综述：使用单细胞和多组学技术解析肺癌免疫微环境异质性与免疫治疗应答的进展

《Current Proteomics》：Advances in deciphering lung cancer immune microenvironment heterogeneity and immunotherapy response using single-cell and multi-omics technologies

　　

背景：PD-1/PD-L1免疫治疗已改变了肺癌的治疗格局，但由于肿瘤免疫微环境（TIME）的异质性，耐药性和差异性应答仍然存在。方法：研究人员回顾了利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学和AI辅助免疫分析所取得的进展，这些技术以前所未有的分辨率解析了TIME异质性。综合了关于肿瘤异质性、T细胞耗竭、髓系极化和基质重编程的关键发现。结果：多组学整合已揭示了耐药机制，并识别了预测性生物标志物（例如，T细胞炎症特征、髓系评分、癌症相关成纤维细胞（CAF）活化状态）。转化应用包括基于TIME的患者分层、联合策略和新辅助免疫治疗。局限性包括高成本、缺乏标准化和批次效应。结论：克服未来的转化瓶颈——降低成本、工作流程标准化和功能验证——需要时空多组学和AI驱动的临床试验。本综述为肺癌精准免疫肿瘤学提供了简明路线图。（图1）

**引言**：肺癌是全球最常见且致死率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%，小细胞肺癌（SCLC）约占15%。传统治疗对晚期患者生存获益有限。靶向程序性死亡受体-1（PD-1）及其配体（程序性死亡配体-1，PD-L1）的免疫检查点抑制剂（ICIs）已扩展了肺癌治疗格局。本综述旨在回答三个关键问题：（1）单细胞和多组学技术如何揭示TIME异质性？（2）免疫治疗耐药背后的机制是什么？（3）这些发现如何指导临床精准免疫治疗？在晚期NSCLC一线治疗中，KEYNOTE-024、KEYNOTE-189、CheckMate 227等III期试验奠定了免疫治疗的基础。对于广泛期SCLC，IMpower133实现了治疗突破。在可切除NSCLC围手术期，CheckMate-816确立了新辅助免疫联合化疗的地位。然而，临床实践中仍存在客观缓解率异质性、原发性/获得性耐药和超进展现象等关键瓶颈。根本原因在于肺癌TIME的高度复杂时空异质性，这成为多组学和单细胞技术深入研究的核心焦点。

**当前TIME研究的知识空白**：传统生物标志物如PD-L1表达和肿瘤突变负荷（TMB）因时空异质性、瘤内取样偏倚和治疗压力下的动态变化而预测价值有限。整体组学方法平均了数百万个细胞的信号，掩盖了稀有但临床意义显著的亚群（如祖细胞耗竭T细胞、SPP1⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）），且未能解析细胞类型特异性调控网络。TIME的空间异质性——包括免疫排斥和免疫荒漠地形、三级淋巴结构（TLS）成熟状态和成纤维细胞屏障组织——在动态应答背景下仍大多未被探索。既往综述分别总结了免疫治疗疗效或单细胞技术，但缺乏整合多组学与肺癌转化免疫治疗机制的综合框架。本综述通过提供将单细胞解析的TIME异质性直接与临床应答和耐药模式联系的关键框架，填补了这些空白，重点关注转化免疫学和新兴的空间多组学策略。

**综述方法**：研究人员在PubMed、Web of Science中进行了系统性文献检索，截止2026年4月，使用组合搜索词包括“lung cancer”、“non-small cell lung cancer”、“small cell lung cancer”、“tumor immune microenvironment”、“single-cell RNA sequencing”、“spatial transcriptomics”、“multi-omics”、“immunotherapy”、“immune checkpoint inhibitors”、“PD-1/PD-L1”、“resistance”和“hyperprogressive disease”。纳入英文同行评审原创研究、临床试验和综述。排除标准包括非英文文章、无全文的会议摘要以及与肺癌免疫微环境或免疫治疗无直接相关的研究。还手动筛选了纳入文章的参考文献列表以确定额外相关研究。

**推动研究实质性进展的技术革命**：以单细胞测序和空间组学为中心的高通量技术取得了突破性发展。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可在单个细胞水平全面分析基因表达特征，有效识别稀有细胞亚群、精确描绘细胞分化轨迹和系统推断细胞间通讯网络。单细胞表观基因组测序技术，包括单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）和单细胞甲基化测序，从表观遗传调控角度提供了对细胞命运决定和功能极化的内在分子机制的深入见解。单细胞免疫组库测序，主要包括T细胞受体和B细胞受体测序，能够特异性追踪适应性免疫细胞在TIME内的克隆扩增、迁移和进化模式。空间转录组学在保留原位空间位置信息的同时进行全转录组检测，可直接可视化肿瘤组织中各种细胞类型的空间分布模式和区域化相互作用。多重免疫荧光和成像质谱流式（IMC）可实现单个组织切片上数十种蛋白标志物的同时检测和定位，构建高维、高分辨率的空间细胞图谱。在此基础上，多组学整合分析利用生物信息学计算模型联合分析转录组、表观基因组、蛋白质组和代谢组等多模态数据，系统构建TIME的多层分子调控网络。典型的多组学整合工作流程包括样本处理、数据整合（批次效应校正、细胞类型注释和跨模态链接、空间映射）和计算挑战（数据稀疏性、模态不一致、高维性）。尽管功能强大，多组学整合面临成本高昂、批次效应和计算算法缺乏金标准基准等关键限制。

**肿瘤细胞的异质性与进化**：基于单细胞转录组测序的多项研究证实肺癌肿瘤细胞存在显著的内部异质性。研究人员将肿瘤细胞分为不同转录组谱的亚群，在增殖能力、代谢状态和上皮-间充质转化（EMT）程度上表现出显著功能差异。整合单细胞水平的拷贝数变异分析可重建瘤内亚克隆进化谱系。不同亚克隆在免疫治疗选择压力下表现出不同的进化轨迹；一些亚克隆通过下调抗原呈递相关基因表达实现免疫逃逸。发生EMT的肿瘤细胞不仅迁移和侵袭能力增强，还上调免疫抑制相关基因。此外，最近的多组学研究揭示了肿瘤细胞异质性的其他维度，包括代谢重编程（糖酵解亚群创造乳酸富集酸性微环境抑制效应T细胞功能）、染色体不稳定性（CIN）产生持续新抗原多样性并通过cGAS-STING通路激活，但持续CIN反而通过诱导适应性转录程序促进免疫逃逸。新抗原进化高度亚克隆性：主干（克隆性）突变衍生的新抗原比亚克隆新抗原更具免疫原性。癌症干细胞（CSC）异质性通过低MHC-I表达、高CD47和PD-L1水平以及内在TGF-β信号传导导致免疫耐药。基因型驱动的免疫表型进一步塑造TIME异质性：KRAS/STK11/LKB1共突变定义中性粒细胞浸润、低T细胞丰度的免疫抑制表型；EGFR突变型肿瘤通常呈现免疫冷表型。瘤内突变梯度——从肿瘤核心到侵袭边缘的突变负荷空间变异——与抗原呈递和免疫选择压力的区域差异相关。

**T细胞耗竭动力学与应答相关性**：T细胞是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，其功能状态与免疫治疗应答密切相关。单细胞转录组分析可清晰区分效应T细胞与耗竭T细胞的表达谱，耗竭T细胞高表达多种免疫检查点分子并下调效应功能相关基因。伪时间分析揭示了T细胞从效应状态到终末耗竭状态的连续分化轨迹，鉴定出中间祖细胞耗竭细胞。这些细胞表达T细胞因子1（TCF1）等转录因子，具有自我更新能力，被认为是应答免疫治疗的重要细胞群体。单细胞T细胞受体测序可追踪特定克隆的扩增和迁移；在免疫治疗应答者中常观察到肿瘤浸润T细胞克隆的显著扩增以及外周血与肿瘤组织之间T细胞克隆的交换。然而，关于祖细胞耗竭细胞的具体标志物及其预测价值仍存在学术争议。最近的研究确定了TOX作为驱动耗竭的主要转录因子，诱导表观遗传重编程锁定CD8⁺ T细胞于功能障碍状态。干细胞样耗竭T细胞（TCF1⁺、MYB⁺、ID3⁺）保留自我更新能力并介导抗PD-1治疗后的增殖爆发。这些TCF1⁺祖细胞定位于特定空间生态位（TLS和血管周围区域）。耗竭可逆性具有亚群依赖性：祖细胞可逆，而终末耗竭细胞保持表观遗传固定。组织驻留记忆T细胞（CD69⁺CD103⁺）处于中间状态，其丰度与肺癌中PD-1/PD-L1抑制剂疗效相关。

**髓系细胞的功能异质性**：髓系细胞是TIME中最丰富的免疫细胞群体，其功能状态直接影响整体抗肿瘤免疫应答。单细胞分析超越了传统M1/M2二分法的局限性，鉴定出多种具有不同转录特征的肿瘤相关巨噬细胞亚群。其中，分泌型磷蛋白1阳性肿瘤相关巨噬细胞（SPP1⁺ TAMs）与肿瘤进展和免疫抑制微环境构建密切相关，而叶酸受体β阳性肿瘤相关巨噬细胞（FOLR2⁺巨噬细胞）与更好临床预后显著相关。单细胞技术还系统区分了常规1型树突状细胞（cDC1）、常规2型树突状细胞（cDC2）和浆细胞样树突状细胞（pDC）等亚型。瘤内cDC1丰度与免疫治疗应答水平呈强正相关。异常扩增的髓源性抑制细胞（MDSCs）通过分泌抑制性细胞因子、消耗关键氨基酸和产生活性氧等多种机制抑制T细胞功能。髓系细胞异质性的临床转化方面：SPP1⁺ TAMs与肿瘤进展和免疫抑制相关；CSF1R抑制剂（如pexidartinib、vimseltinib）正在多项试验中与PD-1阻断联合评估；TAM重编程策略（TLR激动剂、STING激动剂、CD40激动性抗体）在临床前模型和早期试验中显示出疗效；靶向CD47-SIRPα轴的髓系检查点抑制剂（如magrolimab）正在实体瘤中临床开发。此外，肿瘤相关中性粒细胞（TANs）表现出促肿瘤和抗肿瘤双重功能，成为肺癌免疫治疗的新兴靶点。

**基质细胞的重编程与屏障功能**：非免疫细胞在TIME中通过重编程形成促肿瘤表型并构建物理和免疫屏障，显著影响抗肿瘤免疫应答效率。单细胞转录组分析揭示癌症相关成纤维细胞（CAFs）高度异质性，至少包含肌成纤维细胞（myCAFs）、炎性成纤维细胞（iCAFs）和抗原呈递成纤维细胞（apCAFs）等核心亚型。myCAFs高表达α-SMA和FAP，通过分泌胶原蛋白和纤连蛋白等细胞外基质成分增强物理屏障。iCAFs以高分泌白介素-6（IL-6）和C-X-C基序趋化因子12（CXCL12）为特征，调节免疫细胞趋化和活化。apCAFs表达主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II），可与CD4⁺ T细胞相互作用，其功能具有双重性。肿瘤血管内皮细胞表现出异常活化表型，紧密连接破坏和粘附分子表达模式改变，显著阻碍T细胞跨内皮迁移和肿瘤浸润。CAFs与肿瘤细胞协同通过胶原交联、基质硬化和纤维沉积驱动细胞外基质重塑，形成致密物理屏障，同时通过整合素信号通路介导免疫抑制。

**多组学整合**：基因组和表观基因组水平的改变构成TIME异质性的核心分子基础。肿瘤突变负荷和新抗原负荷是重要的免疫治疗应答基因组生物标志物。单细胞技术可精确分析新抗原在不同肿瘤亚克隆中的表达分布，直观揭示亚克隆新抗原异质性。人类白细胞抗原（HLA）I类分子的杂合性丢失是肿瘤免疫逃逸的关键机制；单细胞水平检测可特异性识别特定肿瘤亚克隆中HLA分子的下调或功能丧失。单细胞染色质可及性测序可系统揭示调节免疫细胞功能的表观遗传网络。蛋白质组学可揭示转录组学未完全捕获的蛋白质表达水平功能特征。新兴质谱（MS）单细胞蛋白质组学方法（如SCoPE2、nanoPOTS）现可定量单个细胞中数百种蛋白质，空间蛋白质组学技术（如MALDI-MSI、DESI）可直接在组织切片中映射蛋白质分布。翻译后修饰（PTMs）关键调节免疫信号传导，可通过MS蛋白质组学捕获。蛋白质基因组学整合蛋白质组数据与基因组变异，已鉴定出与免疫治疗耐药相关的新抗原和失调通路。代谢组学与免疫代谢方面：代谢重编程是免疫细胞功能转换的核心驱动因素。单细胞代谢组学技术可准确表征不同肿瘤细胞和免疫细胞亚群的特异性代谢表型。耗竭T细胞普遍存在代谢功能障碍，包括线粒体结构功能损伤、糖酵解异常增强和脂肪酸氧化失衡。CD73-腺苷途径是免疫抑制调节的核心代谢检查点。精氨酸酶和吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO）等代谢分子通过消耗关键氨基酸和调节代谢产物介导免疫抑制。空间组学方面：空间位置关系直接决定细胞间相互作用的可能性和模式。空间转录组学分析清晰显示肿瘤核心、侵袭前沿和远端基质区域之间细胞组成和基因表达特征的系统性区域差异。三级淋巴结构（TLS）是肿瘤相关非淋巴组织中形成的异位功能性淋巴样结构，其存在与免疫治疗应答显著正相关。空间组学技术还能精确描绘免疫排斥和免疫荒漠微环境的空间构型。空间邻近分析整合单细胞转录组数据与空间定位信息，可基于配体-受体配对推断特定细胞类型间的信号通讯。

**免疫治疗应答与耐药的机制剖析**：预测性生物标志物方面，精确识别可能从免疫治疗中获益的患者是实现精准癌症免疫治疗的核心目标。单一生物标志物预测局限性显著；基于多组学整合构建的组合标志物可有效弥补这一缺陷。例如，T细胞炎症特征评分直观反映TIME内抗肿瘤免疫的活化水平；髓系细胞评分以TAMs和MDSCs等亚群丰度为中心，可定量评估微环境免疫抑制程度；CAF活化状态被证实与免疫治疗耐药密切相关。液体活检结合单细胞分析提供了非侵入性动态预测的新策略。单细胞水平分析循环肿瘤细胞可直接获取PD-L1表达和EMT状态等关键表型特征；循环肿瘤DNA检测可定量评估TMB和微卫星不稳定等基因组特征。原发性耐药机制方面，原发性耐药指治疗开始时对免疫治疗缺乏初始应答，涉及肿瘤细胞、免疫微环境和抗原呈递等多个层面的异常。免疫细胞浸润不足是主要因素：免疫荒漠微环境中肿瘤组织整体缺乏有效免疫细胞浸润；免疫排斥微环境中免疫细胞虽丰富但被限制于肿瘤基质。免疫抑制细胞过度富集加重耐药表型，包括MDSCs、M2型TAMs和活化CAFs。抗原呈递相关机制缺陷也导致原发性耐药，包括HLA I类分子下调、β2-微球蛋白功能突变和新抗原丰度或质量不足。获得性耐药机制方面，获得性耐药定义为免疫治疗过程中初始临床获益后出现疾病进展。肿瘤免疫编辑介导的克隆选择是核心驱动因素：对免疫治疗敏感的肿瘤亚克隆被逐渐消除，而携带免疫逃逸特征的耐药亚克隆发生选择性克隆扩增。干扰素-γ（IFN-γ）信号通路关键基因的失活突变（如JAK1、JAK2、STAT1）使肿瘤细胞对IFN-γ信号不敏感，逃避适应性免疫监视。替代性免疫检查点分子（如LAG-3、TIGIT、TIM-3）的上调是另一种重要耐药机制。超进展疾病的机制探索方面，超进展疾病是免疫治疗相对罕见但不利的应答模式，以治疗后肿瘤生长异常加速为特征。核心调控机制尚未完全阐明。免疫检查点阻断可能非特异性激活并驱动调节性T细胞异常扩增，增强TIME内免疫抑制。免疫治疗也可诱导TAMs向促肿瘤M2样表型极化。特定基因组畸变（如MDM2/MDM4扩增、EGFR突变）与超进展疾病风险密切相关。

**临床转化与新型策略探索**：基于微环境分类的精准免疫治疗方面，将单细胞和多组学揭示的TIME特征转化为临床可用的分类工具是迈向精准免疫治疗的关键步骤。免疫炎症型（肿瘤实质内免疫细胞浸润丰富）、免疫排斥型（免疫细胞局限于肿瘤基质）和免疫荒漠型（缺乏有效免疫浸润）三种空间免疫表型中，免疫排斥和免疫荒漠型与免疫治疗耐药紧密相关，而免疫炎症型预示良好治疗结局。基于此可建立免疫分型指导的治疗决策框架：免疫炎症型肿瘤可能单用免疫检查点抑制剂（ICIs）即获得良好应答；免疫排斥型肿瘤更适合ICIs联合抗血管生成药物或基质靶向药物；免疫荒漠型肿瘤可联合ICIs与化疗或放疗诱导免疫原性细胞死亡。然而，临床转化面临成本高昂、缺乏标准化和监管批准缓慢等现实挑战。联合治疗策略的机制基础方面，免疫治疗与化疗联合可通过诱导免疫原性细胞死亡释放肿瘤抗原和损伤相关分子模式，激活适应性抗肿瘤免疫，并调节髓系细胞组成。免疫治疗与抗血管生成治疗联合可诱导肿瘤血管正常化，促进效应T细胞浸润，并下调TAMs和MDSCs的免疫抑制活性。免疫治疗与新型ICIs联合是克服耐药的重要方向，LAG-3抑制剂与PD-1抑制剂联合已在黑色素瘤获批，TIGIT抑制剂和靶向CD39/CD73的抑制剂正在临床研究。免疫治疗与靶向治疗联合需谨慎，对于驱动基因突变患者，联合治疗未显著改善疗效反而增加不良事件风险。新辅助免疫治疗的动态进化方面，新辅助免疫治疗已成为可切除肺癌围手术期治疗的研究热点。单细胞和多组学技术揭示了治疗期间微环境重塑的动态变化：治疗有效驱动肿瘤特异性T细胞克隆扩增、促进抗原呈递细胞活化和成熟，并对肿瘤细胞进行免疫编辑消除具有免疫逃逸潜能的恶性克隆。病理学完全缓解（pCR）与基线及治疗后微环境特征密切相关，包括效应T细胞高丰度、抗原呈递通路活跃和成熟TLS富集。CheckMate-816试验的相关分析系统阐明了新辅助免疫化疗后微环境变化与长期生存的关联。

**挑战与未来展望**：技术挑战方面，当前单细胞和空间组学平台在通量和成本控制方面存在局限；缺乏统一标准的工作流程；多模态数据整合算法需要发展；批次效应严重影响跨研究可比性。生物挑战方面，当前研究大多停留在相关性分析层面，需从观察到相关性过渡到确定因果调控关系。单细胞CRISPR筛选技术可结合高通量基因编辑与单细胞转录组分析，直接鉴定复杂细胞群体中的关键功能基因。功能验证应整合正交方法，包括体内功能获得/丧失研究、体外功能实验等。当前模型系统在准确模拟体内微环境相互作用方面存在显著局限性，包括肿瘤类器官缺乏免疫细胞和基质细胞、微流控装置通量低、人源化小鼠模型成本高且存在不完全造血等问题。未来方向方面，时空多组学的深度整合是主要趋势，通过结合治疗前后动态监测的时间维度与细胞组织定位的空间维度，构建四维动态免疫微环境图谱。人工智能驱动的虚拟临床试验有望提高研发效率。泛癌种比较研究可揭示免疫逃逸和治疗应答的共性机制。此外，数字病理学与单细胞及空间组学的整合、AI驱动的空间病理学、单细胞临床诊断向工作流程的转化、实时免疫监测、多模态基础模型和联邦学习等技术将加速精准免疫肿瘤学的临床采纳。AI与空间多组学的融合，包括空间AI病理学（如STPath、FineST）、多模态转化器在肿瘤学中的应用（如Clinical Transformer、MMTSimTA、CAMFormer）以及AI辅助生物标志物发现，正在推动预测性特征的识别。伦理框架与数据治理方面，单细胞和多组学数据引发基因组隐私和伦理数据共享的关键问题，需控制访问存储库、去标识化和严格数据使用协议。AI在肿瘤学中的偏见挑战要求多样化多民族训练队列、算法公平性约束和事后校准。临床部署伦理需要透明模型解释和独立外部验证。

**作者观点**：基于综合证据，研究人员提出早期治疗期间的动态免疫重塑可能比静态基线特征更具信息性。建议T细胞克隆扩增速率、CD8⁺ T细胞从基质到肿瘤区室的再分布以及TAMs的代谢转换共同构成“应答速度”特征。这一观点挑战了当前静态生物标志物范式，并提出通过微创液体活检（ctDNA和血浆scRNA-seq）在治疗后第2、4、6周进行动态监测可预测长期结局，进一步倡导以实时免疫重塑轨迹指导治疗的适应性试验设计。

**结论**：单细胞和空间多组学已将我们对肺癌TIME的理解从描述性实体转变为高分辨率多维景观，揭示了TIME异质性——跨肿瘤亚克隆、T细胞耗竭状态、髓系极化和基质重编程——直接决定免疫治疗应答或耐药。将这些见解转化为临床实践需要动态监测、基于机制的联合策略和超越相关性的严格功能验证。尽管取得了这些进展，临床实施仍受到高成本、缺乏标准化工作流程、批次效应和跨研究不可重复性、相关性发现的功能验证不足以及算法偏见和数据隐私的伦理问题等阻碍。展望未来，研究人员确定了三个优先领域：将时空多组学整合到适应性临床试验中以指导实时治疗决策；开发具有成本效益的标准化检测用于常规实践；建立多中心、多民族队列，前瞻性收集纵向样本以验证预测性生物标志物并减轻算法偏见。实现这些目标可能有助于推动肺癌免疫治疗向更动态和个性化的方向发展，但仍需大量验证。