许多化学系统看似均匀，只是因为整体测量是对其中最典型的分子进行平均处理的结果。电极表面的电子转移速率各不相同；脂质膜中存在具有不同堆积方式和流动性的纳米结构域；肽聚集体会表现出局部多态性；而生物分子凝聚物则包含在整体图像中难以辨识的短暂相互作用网络。化学成像面临的一个核心挑战不仅是观察更小的结构，还要在单分子层面测定极性、氧化还原电位以及分子受限程度等化学参数。在本文中，我们介绍了如何将荧光团——这类分子的亮度、闪烁、光谱变化、取向、旋转自由度以及运动状态都会受周围环境影响——与单分子取向定位显微镜技术相结合，从而生成纳米尺度化学现象的多维图像。
其核心思路是将荧光团视为分子传感器，而非单纯的被动标记物。它的亮度与闪烁可以反映局部极性或氧化还原状态；其位置能指示事件发生的地点；其取向与旋转自由度则能揭示局部有序性及受限程度；而其运动轨迹则可显示分子的传输过程或局部粘弹性特征。通过构建对单分子极化敏感的显微镜，我们能够同时测定分子的取向与摆动情况，以及纳米尺度上的位置与强度信息。因此，单分子取向定位显微镜为从单个荧光团中提取多维化学信息提供了必要的光学与计算手段。
首先，我们介绍了基于SM的电化学成像技术，这种技术利用对氧化还原反应敏感的荧光团来反映局部电位中点，从而揭示出被整体平均处理所掩盖的电子转移行为的空间差异，同时也能展示氧化还原介质如何影响荧光团的还原过程。接着，我们探讨了脂质膜的研究，诸如尼罗红和美蓝540这类溶剂致色性亲脂探针能够检测局部堆积状况、极性及流动性。通过测定分子的旋转与平动动力学，SMOLM技术表明，富含胆固醇的膜区域虽然会限制分子的取向，但仍然允许分子发生非均匀的跳跃式侧向运动；同时，细胞膜的曲率与成分差异也会导致分子取向的时空变化。
在肽类及淀粉样蛋白聚集体中，那些能够暂时结合的荧光团可将表面化学信息转化为纳米尺度的结构信息。尼罗红的取向变化能够反映纤维状结构的排列方式、无序程度及多态性，从而区分出已成熟的结构区域与新形成的或无序的分支结构，还能揭示出仅靠位置分辨的超分辨率显微镜无法观测到的螺旋状双层结构。最后，我们讨论了生物分子凝聚物的研究，这类物质中的环境敏感型荧光团能够展现那些在衍射极限成像下看似均匀的液滴内部的纳米级结构。SM技术可通过追踪荧光团的运动路径来确定疏水中心的位置，速度分辨图谱则能揭示出受限的微相结构，荧光团的移动性则可用于分析本征无序蛋白质的序列差异，而SM跟踪技术还能揭示RNA凝聚物边界处的各向异性扩散现象。
综上所述，这些实例都表明，荧光显微镜所能提供的最丰富信息往往不仅在于分子所处的位置，还在于其行为特性。更重要的启示是，在选择荧光团时，不应仅考虑其亮度或光稳定性，还应关注它们所能反映的化学参数。通过将荧光团化学性质、光学设计以及计算成像技术相结合，单荧光团取向定位显微镜为我们提供了一种以纳米级精度观测化学环境、分子结构以及非平衡动态现象的方法。本质上，单个荧光团便成为了展现化学反应过程的定量检测工具。
