环孢素A预暴露使巴西副球孢子菌预适应以逃避宿主免疫

《ACS Infectious Diseases》：Pre-Exposure to Cyclosporine A Primes Paracoccidioides brasiliensis to Evade Host Immunity

　　

副球孢子菌病（PCM）是一种由副球孢子菌属（Paracoccidioides）的热二态性真菌引起的南美洲地方性系统性真菌病，特别是巴西副球孢子菌（P. brasiliensis）。环孢素A（CsA）对钙调神经磷酸酶（calcineurin）的抑制会干扰真菌的热二态性和生长。在此，研究人员询问了巴西副球孢子菌酵母细胞预暴露于CsA是否会在感染期间调节宿主-病原体相互作用。感染了CsA预暴露真菌的小鼠表现出显著降低的促炎和抗炎细胞因子水平，以及在两个时间点先天性和适应性免疫细胞的募集和活化减少。尽管组织炎症和病变区域减少，但两组之间的肺和肝脏真菌负荷相似。重要的是，在感染CsA预处理真菌后72小时从肺中回收的酵母菌在体外显示出降低的菌落生长，表明先前的CsA暴露诱导了一种持续缓慢生长的生理状态。这种改变的表型可能损害有效的免疫识别和炎症活化。由于实验设计中排除了宿主免疫抑制，真菌内在表型与瞬时钙调神经磷酸酶通路抑制一致：改变的生长/形态发生和推测的修饰的病原体相关分子模式（PAMP）暴露，共同削弱了早期免疫活化。研究人员将晚期阶段差异解释为这些早期通路依赖变化的后续效应，而非可遗传的重编程。总体而言，预暴露于CsA调节了巴西副球孢子菌与宿主的相互作用，将组织损伤与真菌负荷分离，突出了钙调神经磷酸酶在真菌适应中的作用，并证明了环境暴露于生物活性化合物如何影响真菌毒力和疾病结局。

**论文解读：环孢素A预暴露预适应巴西副球孢子菌以逃避宿主免疫**

**研究背景与问题**

副球孢子菌病（PCM）是由副球孢子菌属（Paracoccidioides）热二态性真菌（主要是巴西副球孢子菌 P. brasiliensis）引起的南美洲地方性系统性真菌病，是拉丁美洲最流行的系统性真菌病，也是巴西真菌感染相关死亡的首要原因。钙调神经磷酸酶（calcineurin）是真核生物中高度保守的钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在真菌中调控菌丝生长、离子稳态、耐热性、细胞壁维持和应激适应，对毒力至关重要。环孢素A（CsA）是钙调神经磷酸酶抑制剂，能干扰巴西副球孢子菌的菌丝-酵母转变和酵母增殖。然而，钙调神经磷酸酶在宿主T细胞活化中同样关键，CsA作为免疫抑制剂广泛用于器官移植和自身免疫疾病，因此针对钙调神经磷酸酶的抗真菌治疗因同时抑制宿主免疫而不被看好。以往研究大多将CsA给予宿主，导致结果矛盾，难以区分对病原体和宿主的直接作用。此外，CsA是土壤微生物产生的天然产物，可能存在于真菌环境中，但环境暴露对病原体预适应的影响尚未被探索。目前存在的主要问题包括：PCM长期治疗易导致纤维化后遗症；真菌耐药性增加；需要新策略；钙调神经磷酸酶作为靶点因宿主免疫抑制而受限；环境中的CsA可能预适应真菌，但缺乏实验证据。

**研究目的与主要技术方法**

本研究旨在明确：在排除宿主免疫抑制的条件下，体外短暂暴露巴西副球孢子菌酵母于CsA，是否通过病原体内在效应调节宿主-病原体相互作用，从而影响疾病结局。研究人员采用了以下关键技术方法：1）真菌培养与CsA处理：巴西副球孢子菌Pb18酵母在含1 μg/mL CsA的Ham's F-12培养基中培养24小时，随后通过五次PBS洗涤洗脱CsA，并分散至单细胞悬液。2）小鼠感染模型：使用8-12周龄雄性C57BL/6小鼠（来源：CEDEME-UNIFESP），经气管内接种10⁶酵母细胞，分别于急性期（72小时）和慢性期（8周）分析。3）真菌负荷评估：通过组织匀浆涂板计数菌落形成单位（CFU），结果以每克组织的log₁₀ CFU表示。4）组织病理学：用苏木精-伊红（H&E）和银染染色，测量病变面积。5）细胞因子检测：用ELISA检测肺、肝和脾匀浆中多种细胞因子水平。6）流式细胞术：分析肺浸润白细胞亚群，包括髓系细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及CD4⁺和CD8⁺ T细胞的活化标志物和细胞内细胞因子。7）统计分析：使用Student's t检验。

**研究结果**

**CsA预暴露在体外诱导持续生长抑制而不丧失活力**
体外生长曲线显示，CsA预处理的酵母在72小时内生长速率显著降低，且这种抑制在连续传代后持续数周。感染后72小时从肺回收的酵母在体外再培养时，初始几天菌落增长延迟，但第6天后两组菌落数趋于一致，表明活力保留但增殖延迟。

**慢性感染期间组织炎症减轻而真菌负荷保留**
组织学分析表明，急性期（72小时）肺病变面积无差异；慢性期（8周）时，感染CsA预处理真菌的小鼠肺中出现更小的肉芽肿性病变和更小的炎症区域，肝脏病变面积也减少。然而，肺和肝脏的真菌负荷在两组间相似，脾脏中真菌负荷则降低。

**急性感染期细胞因子产生减弱**
感染72小时后，感染CsA预处理真菌的小鼠肺匀浆中多种促炎和抗炎细胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-1_β、IFN-γ、IL-10）水平显著降低，而单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）水平无差异。

**慢性感染期细胞因子产生持续减弱**
感染8周后，肺、肝和脾中多种细胞因子水平在感染CsA预处理真菌的小鼠中显著降低，包括IL-1_β、TNF-α、TGF-β、IL-10、MCP-1、IFN-γ、IL-22、IL-12、IL-4、GM-CSF、IL-17、IL-6和IL-23（肺中IL-23无差异）。这些细胞因子谱不匹配经典的Th1、Th2或Th17极化模式。

**CsA预处理减少早期固有免疫细胞向肺的募集**
流式细胞术显示，感染72小时后，感染CsA预处理真菌的小鼠肺中总白细胞（CD45⁺）、总髓系细胞（CD45⁺CD11b⁺）、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞的频率和数量均显著降低。

**巨噬细胞和树突状细胞的活化表型降低**
感染72小时后，感染CsA预处理真菌的小鼠肺中，表达CD40、CD80、CD86和MHC-II的巨噬细胞和树突状细胞的频率和数量均降低，表明抗原呈递能力受损。

**T淋巴细胞亚群的募集和活化减弱**
感染72小时后，感染CsA预处理真菌的小鼠肺中CD4⁺ T细胞的总频率和数量、活化CD4⁺CD25⁺ T细胞、Th1（IFN-γ⁺）、Th2（IL-4⁺）、Th17（IL-17⁺）和调节性T细胞（Foxp3⁺）亚群均显著降低。CD8⁺ T细胞总频率无变化，但活化CD8⁺CD69⁺细胞及Tc1、Tc2、Tc17亚群减少。

**讨论总结与结论**

讨论部分强调，实验设计排除了宿主免疫抑制，CsA暴露仅限体外真菌，小鼠未经CsA处理。通过使用非免疫抑制的CsA类似物alisporivir（Debio 025，抑制亲环蛋白但不抑制钙调神经磷酸酶）进行验证，发现它在体外未影响酵母生长，而CsA改变了生长/形态，表明所观察到的表型归因于钙调神经磷酸酶抑制而非亲环蛋白效应。研究人员认为，CsA预暴露导致真菌生长减慢和可能的细胞壁病原体相关分子模式（PAMP）暴露改变，提高了先天免疫感知阈值，限制了炎症放大，但允许真菌持续存在和播散，同时减少组织损伤。这表现为毒力降低（宿主损伤程度）而致病性保留（建立感染能力）。晚期差异是早期通路依赖变化的后续效应，而非可遗传重编程。此外，这一发现具有生态学意义：CsA是土壤微生物产生的天然产物，可能预适应环境中的真菌，从而影响PCM的疾病结局。研究结论如下：巴西副球孢子菌酵母细胞预暴露于环孢素A，随后洗脱，产生了与瞬时钙调神经磷酸酶抑制一致的真菌内在表型：洗脱后持续抑菌行为、免疫活化减弱和组织损伤减少，尽管肺真菌负荷相当。研究人员将晚期差异解释为早期通路依赖的定植和免疫设定点变化的后续效应，而非可遗传的重编程。除了钙调神经磷酸酶生物学，这些发现突显了环境生物活性化合物如何预适应二态性真菌并塑造疾病结局，支持了一种由病原体预适应驱动的非经典PCM结局谱。