电解质、施加电压和DNA浓度对单链DNA通过固态纳米孔易位动力学的影响

《ACS Omega》：Effect of Electrolyte, Applied Voltage, and DNA Concentration on the Translocation Dynamics of a Single-Stranded DNA through a Solid-State Nanopore

　　

固态纳米孔（SSNP）能够在分子易位过程中通过监测离子电流调制实现无标记生物分子检测。然而，可靠的测量常常受到快速、控制不佳的易位动力学的限制，这会产生短且低分辨率的信号。施加电压、缓冲液组成和分析物浓度影响分子传输，但在离子环境（包括Tris基缓冲液）中的综合效应仍未被充分理解。本研究（研究人员）调查了施加电压、DNA浓度和缓冲液组成对环状7560核苷酸单链DNA（ssDNA）易位动力学以及电流阻塞特性的影响。研究人员比较了两种电解质环境：HEPES中的氯化锂（LiCl/HEPES）与补充有K⁺和Mg²⁺阳离子的三硼酸-EDTA（TBE）。两种电解质环境在离子组成和离子强度上存在差异，导致不同的易位行为。随绝对施加电压增加，所有DNA浓度下的驻留时间（dwell time）减少，电流阻塞（current blockage）增加。LiCl/HEPES缓冲液产生较慢的易位，具有宽的驻留时间分布，而补充有K⁺和Mg²⁺阳离子的TBE产生更快的易位事件，具有更窄的驻留时间群体和更低的电流阻塞幅度。研究人员得出结论：电解质环境是优化固态纳米孔性能和提高单分子传感可靠性的关键因素。

**研究背景与问题**
固态纳米孔（SSNP）技术已成为单分子生物传感的重要平台，广泛应用于DNA、RNA和蛋白质测序等研究领域。然而，该技术面临两大持续挑战：操作稳定性差和分子选择性不足。其中一个主要限制是分子易位动力学的有限控制——分子通常以微秒时间尺度通过纳米孔，产生短且低分辨率的信号，阻碍了准确识别并降低了分析灵敏度。此外，驻留时间和电流阻塞幅度的变化，源于分子构象差异及其与纳米孔表面的相互作用，使信号处理复杂化并降低测量重现性。因此，控制易位速度和一致性对于提高信号分辨率和实现可靠的单分子分析至关重要。现有研究已表明，单价阳离子（K⁺、Na⁺、Li⁺）对DNA易位有不同影响，其中Li⁺导致更慢的易位。然而，在分子生物学中常用的Tris基缓冲液（如TBE）中的易位行为研究相对有限，特别是在与LiCl/HEPES系统的对比方面。本研究旨在系统调查施加电压、DNA浓度和缓冲液组成（LiCl/HEPES vs TBE补充K⁺和Mg²⁺）对环状单链DNA易位动力学的影响，以提供优化SSNP测量条件的实用指导。

**研究内容与结论**
研究人员使用可控介电击穿（CDB）方法制备了直径约16 nm的氮化硅（SiN）纳米孔，以环状ssDNA p7560（7560核苷酸，常用于DNA折纸支架链）为分析物，在两种缓冲液体系（3.6 M LiCl/10 mM HEPES，pH 8；0.5× TBE/5.5 mM MgCl₂/1 M KCl，pH 8）中，施加-50 mV至-100 mV电压，浓度3-5 nM条件下，通过高带宽低噪声电压钳放大器记录离子电流，分析了易位事件（驻留时间和电流阻塞）的统计特性。主要结论：LiCl/HEPES体系产生较慢的易位（驻留时间在毫秒量级）和较高的电流阻塞幅度，易于在50 kHz带宽下可靠检测；TBE体系产生极快的易位（驻留时间在数十至数百微秒）和较低的电流阻塞幅度，需要100 kHz更高带宽和更严格的检测阈值。两种体系下的捕获频率均随浓度近线性增加，符合扩散限制捕获模型；驻留时间随绝对电压增加而减小，在LiCl/HEPES中呈幂律关系，表明较大的孔径（~16 nm）使环状ssDNA的紧密二级结构无需完全解缠绕即可通过，易位受电泳驱动主导；而在TBE体系中电压依赖性更弱。LiCl/HEPES中还观察到一小部分长驻留时间、弱电压依赖的事件，归因于DNA-表面相互作用。该论文发表在《ACS Omega》。

**主要技术方法**
研究人员采用可控介电击穿（CDB）技术在带薄氧化层的SiN膜（窗口厚度12±2 nm，尺寸40 μm×40 μm，供应商NORCADA）上制备纳米孔，初始孔径约15.1 nm，经老化稳定后最终孔径约16.0 nm（通过I-V曲线和Kowalczyk模型计算）。易位测量使用高带宽低噪声电压钳放大器（VC100，Chimera Instruments），采样率4.17 MHz，模拟带宽1 MHz，施加电压-50 mV至-100 mV，每次测量25秒。事件检测和分析使用Nanolyzer软件（Northern Nanopore Instruments）和Poriscope（Version 1.5.0），检测阈值500 pA，最小事件持续时间1 μs。数据后处理包括数字滤波（LiCl/HEPES用50 kHz低通Bessel滤波器，TBE用100 kHz滤波器），以及基于正态分布的对数驻留时间和电流阻塞分布拟合。双因素方差分析（2-way ANOVA）和Tukey事后检验用于统计比较。样本为环状ssDNA p7560（来源于Tilibit Nanosystems）。

**研究结果**
**LiCl/HEPES缓冲液中的易位特征**：在3.6 M LiCl/10 mM HEPES中，环状ssDNA易位事件产生清晰可辨的电流阻塞尖峰，基线稳定，信噪比（SNR）高。驻留时间在数毫秒量级，随绝对电压增加而显著减小（5 nM时中位驻留时间从-50 mV的9860 μs降至-100 mV的995 μs），呈幂律关系。电流阻塞幅度随电压增加从2.4 nA增至5.2 nA。浓度增加主要提高事件捕获频率，对驻留时间和电流阻塞影响较小，但增加变异。部分事件表现出极长驻留时间（~100 ms）和弱电压依赖性，归因于DNA-表面相互作用。

**TBE缓冲液中的易位特征**：在0.5× TBE/5.5 mM MgCl₂/1 M KCl中，易位事件数量显著更多，但驻留时间极短（5 nM时中位驻留时间从-50 mV的145 μs降至-100 mV的72 μs），比LiCl/HEPES短约14-70倍。电流阻塞幅度较低（0.8-1.6 nA），且分布在较窄范围内。电压依赖性较弱，-80 mV和-100 mV分布部分重叠。浓度增加导致事件捕获频率增加，但中位驻留时间变化不大，变异增大。该体系下的低SNR使事件检测更困难，需要更高带宽和更严格阈值。

**总结与结论翻译**
本研究表明，如果缓冲液选择不当，仅增加施加偏压不足以确保高质量的纳米孔测量。在LiCl/HEPES中，环状ssDNA易位事件更长且具有更高幅度，因此在50 kHz标准采集带宽下易于与噪声区分。相反，补充有K⁺和Mg²⁺离子的Tris-硼酸系统导致非常快速的易位，这降低了SNR，需要100 kHz的更高采集带宽和更严格的检测阈值才能可靠地检测单个事件。研究人员强调，两种缓冲液系统同时在多个参数（阳离子类型、盐浓度、离子强度和Mg²⁺离子存在）上存在差异，因此观察到的差异表征了两种完整的离子环境，而非任何单一变量的效应。捕获频率随环状ssDNA浓度近似线性增加，符合扩散限制捕获模型，驻留时间随绝对电压增加而减小，呈幂律关系，与电泳传输一致。LiCl/HEPES中长事件弱电压依赖的亚群与CDB制备的SiN纳米孔中的DNA-表面相互作用一致。此外，与Kowalczyk等人报道的M13mp18通过~7 nm纳米孔时的指数电压依赖性相比，本研究中LiCl/HEPES中驻留时间的幂律电压依赖性表明，鉴于本研究中使用的较大孔径（~16 nm），环状ssDNA紧密二级结构的完全解缠绕不太可能是易位中的主要限速步骤。观察到的电压依赖性更符合电泳驱动传输，其中Li⁺阳离子与DNA之间的相互作用可能有助于观察到的减慢，同时还有电解质组成相关的其他效应以及易位过程中环状ssDNA分子部分构象重排的可能贡献。相比之下，Tris基系统显示出显著更短的驻留时间（主要在数十至数百微秒范围内）以及更低的电流阻塞幅度。在这种情况下，不同的离子环境与较大的纳米孔孔径（减少几何约束）相结合导致快速的分子易位。DNA浓度主要影响事件率，而单个事件的特征主要由施加电压和离子环境决定。因此，对于可靠的单分子检测，选择延长驻留时间并增加阻塞幅度的条件至关重要。总体而言，这些发现为设计可靠的SSNP实验以检测长环状ssDNA提供了实用指南，并可转移到其他相关应用，包括未来将DNA折纸结构集成到固态纳米孔中。在本系统中，这通过使用LiCl/HEPES实现，它允许在50 kHz标准采集设置下可靠检测和表征长环状ssDNA的易位事件，而当使用补充有K⁺和Mg²⁺离子的Tris-硼酸系统时，有必要降低电压和/或增加采集带宽并应用更严格的检测阈值以捕获非常短且低幅度的事件。