《Cell Reports Methods》：Volumetric denoising enables high-throughput volume electron microscopy and efficient downstream analysis
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体电子显微镜（volume electron microscopy，VEM）通过连续切片和成像实现了生物样本的纳米分辨率三维（3D）可视化。由于下游分析的限制，VEM数据集通常以慢速和高分辨率获取，从而限制了可实现的成像通量。通过系统搜索最优VEM采集条件，研
体电子显微镜（volume electron microscopy，VEM）通过连续切片和成像实现了生物样本的纳米分辨率三维（3D）可视化。由于下游分析的限制，VEM数据集通常以慢速和高分辨率获取，从而限制了可实现的成像通量。通过系统搜索最优VEM采集条件，研究人员发现足够的空间分辨率能有效对抗高图像噪声，以保持3D结构信息。为进一步验证去噪在恢复体积数据集方面比轴向插值更有效，研究人员比较了基于机器学习的方法，包括一种新开发的基于3D上下文的去噪模型，通过在同时获取的VEM数据集上执行各种任务。研究人员的体积方法不仅在忠实特征恢复方面优于其他基线方法，而且通过允许快速成像，促进了低至20 nm的稳健串行块面切割。这项工作提供了优化的采集策略和体积去噪方法，作为最大化VEM通量的可行指南。
**论文解读：体积去噪赋能高通量体电子显微镜与高效下游分析**
**研究背景与问题**
体电子显微镜（volume electron microscopy，VEM）是一类通过连续切片或逐层表面烧蚀（如串行块面扫描电子显微镜[serial block-face scanning electron microscopy，SBF-SEM]和聚焦离子束扫描电子显微镜[focused ion beam scanning electron microscopy，FIB-SEM]）获取树脂包埋样本三维（3D）纳米级结构的技术。尽管横向分辨率可达5 nm，但轴向分辨率（即切片厚度）受机械切割或离子束加工限制，通常为25–50 nm，且进一步提高轴向采样率会显著降低成像通量。此外，延长像素驻留时间虽能提升图像信噪比（signal-to-noise ratio，SNR），但会导致电子束损伤，降低树脂表面可切割性，反而限制轴向分辨率。因此，VEM采集面临一个核心矛盾：应当优先选择更长的像素驻留时间以改善SNR，还是更小的像素尺寸和更薄的切片以提升空间分辨率？现有基于人工智能（artificial intelligence，AI）的图像恢复方法（如去噪和插值）多侧重于后处理，但缺乏对采集条件与模型性能之间关系的系统性验证。为此，研究人员开展本研究，旨在通过建模和实验确定最优采集策略，并开发一种基于3D上下文的体积去噪方法，以最大化VEM通量并促进下游分析。
**研究结论与意义**
研究人员通过定量分析发现，足够高的空间采样率（轴向分辨率）比高SNR更能有效保持3D结构信息，并定义了“舒适区”采集参数范围。在此基础上，研究人员开发了一种基于3D上下文的自监督体积去噪（volumetric denoising，v-denoising）模型，该模型在真实SBF-SEM和FIB-SEM数据集上优于轴向插值和二维去噪方法，在努力忠实特征恢复的同时，通过快速成像实现了低至20 nm的稳健串行块面切割。此外，v-denoising显著提升了自动细胞器分割和神经突重建的精度，节省了约29%的人工校对时间。该研究为最大化VEM通量提供了优化采集策略和可操作的去噪方法，论文发表在《Cell Reports Methods》。
**主要关键技术方法**
研究人员使用公共FIB-SEM数据集（小鼠海马CA1区，各向同性体素5 nm）通过噪声掩蔽和空间下采样生成合成数据，模拟不同切片厚度和SNR的组合。在SBF-SEM（Zeiss Gemini300，配备Gatan 3View2XP）上设计混合成像例程，交替以2.0 μs/像素和0.5 μs/像素驻留时间获取同一层面的高、低SNR图像对，并构建参考栈、快照栈及混合栈。开发了基于GShiftNet的3D上下文去噪模型，支持有监督和自监督训练；采用Sectional Fourier Shell Correlation（SFSC）评估有效空间分辨率，使用结构相似性指数（SSIM）量化层间连续性。样本来源为成年C57BL/6小鼠脑组织（购自上海吉辉实验动物饲养有限公司）及先前发表的斑马鱼脊髓SBF-SEM数据集。
**研究结果**
**1. 不同采集设置下的结构信息保真度**
研究人员通过合成FIB-SEM数据集（图1）和真实等离子体FIB-SEM验证数据（图1E–1G），发现轴向采样率（Z方向切片数量）对数据集有效分辨率的影响远大于图像SNR。高Z采样率的数据集在低SNR下仍能保持良好的有效分辨率，形成“舒适区”（图1D）。进一步，自动线粒体分割实验（图2）表明，高Z采样率的数据集即使SNR不高，分割误差仍较低，且有效分辨率与分割精度呈强正相关（R2=0.635）。
**2. 基于机器学习的序列图像恢复**
研究人员利用SBF-SEM混合成像例程（图3A–3B），比较了轴向插值（RIFE模型）与体积去噪（有监督v-denoising）的性能。结果表明，v-denoising在有效XZ分辨率提升和层间结构连续性（SSIM）方面均显著优于插值和二维去噪（图3C–3F）。此外，在混合输入中加入高SNR参考帧并未改善v-denoising输出，表明模型主要依赖轴向采样密度而非参考帧质量。
**3. 针对体积去噪优化VEM采集**
研究人员在SBF-SEM上以0.5 μs/像素驻留时间、不同切片厚度（50、25、20 nm）采集快照数据集，使用自监督v-denoising训练（图4）。结果显示，去噪后有效XZ分辨率与名义切片厚度呈线性相关（R2=0.994），20 nm切片厚度的数据集去噪后有效分辨率达83.6 nm，且v-denoising在切片厚度小于75 nm时优势明显（图4G）。短驻留时间减少了电子束损伤，使SBF-SEM切割厚度降至20 nm。
**4. 体积去噪促进下游VEM分析**
研究人员在等离子体FIB-SEM数据集上比较了Fiji平滑、Blind2Unblind、DeepSeMi和v-denoising四种方法（图5）。v-denoising在自动线粒体分割（IoU 0.759）和突触分割（IoU 0.477）中均取得最高精度，接近参考数据集（线粒体0.785，突触0.529）。在斑马鱼脊髓SBF-SEM子体积上，v-denoising将神经突过分割计数从5.607/μm降至3.950/μm（p=0.016），并将手动校对时间从1.01 min/μm降至0.72 min/μm（p=0.031），节省29%人力（图6）。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，VEM成像本质上是一个三维数字化过程，空间采样率（轴向分辨率）对结构信息保真度起决定性作用，而高SNR并非必需。研究人员提出的“舒适区”概念为采集参数选择提供了量化依据。自监督v-denoising无需参考帧，可广泛适用于不同组织和VEM模态，且短驻留时间策略有利于SBF-SEM实现更薄切片。此外，v-denoising通过减少分割错误显著加速下游分析，有望集成到实时成像系统中以进一步自动化。
**研究结论翻译**：总结而言，本研究通过定量分析证明，足够的VEM空间采样在有效保持结构信息中起关键作用。此外，研究人员提供了一种基于机器学习的体积去噪方法，用于图像栈恢复，具有卓越的准确性。跨数据集和跨VEM模态验证确认，该体积去噪方法不仅有利于SBF-SEM轴向分辨率的提升，还惠及多种VEM下游分析任务。此外，体积去噪的概念可能适用于其他用于连接组学的高通量成像模式，包括X射线断层扫描，甚至扩展光学显微镜。
