使用工程化AAV载体靶向脂肪组织中的外周神经系统

《Cell Reports Methods》：Targeting the peripheral nervous system in adipose tissue with engineered AAV vectors

　　

脂肪组织神经支配在调节能量稳态和代谢功能中发挥关键作用，然而，靶向这些外周神经的基因递送仍然具有挑战性。研究人员系统评估了天然发生和工程化的腺相关病毒（AAV）衣壳在小鼠脂肪组织神经纤维中的转导能力。研究人员比较了七种AAV（AAV1、AAVrg、AAV5、AAV9、AAV-PHP.S、AAV-MaCPNS1和AAV-MaCPNS2）在C57BL/6J小鼠中的效果，并确定AAV-PHP.S在转导腹股沟皮下白色脂肪组织（ing-scWAT）神经方面具有高效性。滴定研究进一步优化了脂肪内递送，以最小化脱靶表达，同时选择性靶向脂肪组织神经。基于这一优化，研究人员采用Cre依赖性AAV选择性靶向ing-scWAT中的Nav1.8⁺感觉神经，实现了基于Tetbow的多色轴突标记和化学遗传效应器的递送。总之，这些发现建立了AAV转基因递送至脂肪神经的条件，为机制研究和神经病变治疗的开发提供了机会。

**论文解读**

**研究背景与问题**

脂肪组织受外周神经密集支配，这些神经调节代谢功能并支持与神经系统的双向通讯。然而，用于选择性标记、映射和操控脂肪相关神经的工具仍然有限。现有的腺相关病毒（AAV）策略主要针对中枢神经系统（CNS）或其他外周组织进行优化，使得脂肪感觉和交感回路难以研究。脂肪组织神经支配的丧失（“脂肪神经病变”）已在衰老或肥胖的人类以及小鼠模型中被发现，且手术或化学去神经研究表明，健康神经支配的丧失会负面影响全身代谢并加剧肥胖相关病理。因此，开发针对脂肪神经支配的AAV工具对于推进代谢神经回路的研究至关重要。

**研究内容与结论**

本研究系统优化了AAV介导的脂肪组织外周神经转基因递送。研究人员首先通过全身注射和强效启动子进行广泛筛选，然后逐步缩小策略，以实现对单个脂肪库中神经亚型的靶向转导，并表达兴奋性化学遗传学受体（DREADD）。主要结论包括：AAV-PHP.S被鉴定为高效转导腹股沟皮下白色脂肪组织（ing-scWAT）神经的衣壳；通过滴定优化了脂肪内递送，最小化脱靶表达；利用Cre依赖性AAV选择性靶向Nav1.8⁺感觉神经，实现了Tetbow多色轴突标记和化学遗传学激活。这些发现建立了AAV转基因递送至脂肪神经的条件，为机制研究和神经病变治疗提供了机会。该论文发表在《Cell Reports Methods》。

**主要技术方法**

研究人员在C57BL/6J小鼠（来自Jackson Laboratory）中系统评估了七种AAV衣壳（AAV1、AAVrg、AAV5、AAV9、AAV-PHP.S、AAV-MaCPNS1和AAV-MaCPNS2）的转导效率。采用全身性眼眶后静脉注射（r.o.）和靶向脂肪内经皮微注射（i.a.）两种递送途径。通过Cre/lox系统（FLEX/ DIO）实现神经元亚型特异性表达，使用Tetbow双组分系统（AAV-tTA和AAV-3XFP）进行多色轴突标记。通过化学遗传学（DREADD）结合活体钙成像（GCaMP6s）验证功能活性。

**研究结果**

**Determination of AAV capsids that effectively transduced adipose tissue nerves via systemic injection**
通过全身注射1×10¹² vg/只小鼠的七种AAV衣壳（携带CAG启动子驱动的荧光蛋白），发现AAVrg、AAV9和AAV-PHP.S在转导ing-scWAT神经方面表现出最高潜力。免疫标记显示，AAVrg、AAV9和PHP.S共同标记了酪氨酸羟化酶（TH）⁺和降钙素基因相关肽（CGRP）⁺轴突。而MaCPNS2优先标记CGRP⁺轴突。AAV-PHP.S在背根神经节（DRG）和坐骨神经中表现出增强的标记效果。

**Optimization of systemic and intra-adipose AAV delivery**
比较CAG、EF1α和hSyn1启动子发现，hSyn1严重限制了ing-scWAT轴突的转基因表达。通过滴定降低全身注射滴度至5×10¹¹ vg/只仍能保持高效转导。脂肪内注射（i.a.）1×10¹¹ vg/组织可特异性靶向同侧ing-scWAT，避免对侧组织污染，且约42%–54%的霍乱毒素B亚基（CTB）示踪神经元被转导。

**AAV-PHP.S Cre-mediated transgene expression in ing-scWAT**
在Nav1.8-Cre::ZsGreen1小鼠中，通过脂肪内注射3×10¹¹ vg/组织的AAV-PHP.S-CAG-FLEX-tdTomato，实现了Cre依赖性tdTomato在DRG（T11-L3）和ing-scWAT Nav1.8⁺感觉轴突中的表达，约30%的Nav1.8⁺轴突面积共表达tdTomato，且主要限于Nav1.8⁺轴突（多数共表达CGRP）。在交感链神经节（SChG）中未观察到转基因表达。

**Testing the broader applicability of Cre-dependent AAV-PHP.S in adipose tissue**
通过全身注射3×10¹² vg/只的AAV-PHP.S-CAG-FLEX-tdTomato至Nav1.8-Cre小鼠，在多个脂肪库（包括BAT、ax-scWAT、popWAT、mesWAT、pgWAT、rpWAT、prWAT和PVAT）中均观察到tdTomato标记的轴突。此外，对TH-Cre和NET-Cre小鼠的评估显示，这些Cre系在脂肪组织中存在广泛的非神经元脱靶/泄漏表达，不适合用于脂肪神经特异性研究。

**Tetbow multicolor labeling of adjacent axons in ing-scWAT**
通过向Nav1.8-Cre小鼠脂肪内注射Tetbow AAV混合物（AAV-tTA和三种AAV-3XFP），在ing-scWAT中实现了可调节的多色感觉轴突标记，且可区分相邻轴突。通过调整AAV-tTA滴度可控制标记密度，且可与免疫荧光联合使用（如标记PGP9.5、CGRP、TH）。相较之下，Brainbow方法在脂肪神经中未能实现可靠的多色标记。

**Chemogenetic neuromodulation of ing-scWAT sensory activity**
研究人员构建了AAV-PHP.S-EF1α-FLEX-HA-hM3Dq（AAV-DREADD），通过脂肪内注射（3×10¹¹ vg/组织）至Nav1.8-Cre::GCaMP6s小鼠，实现了选择性兴奋性DREADD在Nav1.8⁺/CGRP⁺感觉轴突中的表达。活体钙成像显示，腹腔注射DREADD激动剂去氯氯氮平（DCZ）后，仅AAV-DREADD转导的Cre阳性小鼠的神经束中出现显著的GCaMP荧光信号，而Cre阴性或AAV阴性对照组无变化。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究建立了AAV介导脂肪组织神经转导的框架，并强调了载体选择、启动子选择和组织特异性因素之间的复杂相互作用。AAV-PHP.S相比AAV9在脂肪神经转导方面具有优势，但不同脂肪库（如BAT与scWAT）间存在差异。Tetbow方法为脂肪神经高分辨率多色标记提供了新工具，优于传统Brainbow。DREADD方法实现了精准的脂肪感觉神经化学遗传学调控。局限性包括早期筛选样本量小、定性评估为主，且神经元特异性取决于Cre-driver线的质量。此外，AAV 4.7 kb的包装容量限制了设计选择。

**研究结论翻译**：总体而言，本研究建立了AAV介导脂肪组织神经转导的框架，并突显了载体选择、启动子选择和组织特异性因素之间的细致相互作用。这项工作为更好地理解脂肪组织神经支配以及开发代谢性和神经病变疾病的靶向治疗干预奠定了基础。