一个代谢组学方法研究组蛋白甲基转移酶特异性探针UNC1999对内生真菌Xylaria papulis Lloyd中隐蔽代谢物的影响

《Frontiers in Microbiology》：A metabolomics approach to target the effect of histone protein methyltransferase-specific probe UNC1999 on cryptic metabolites in an endophytic fungus Xylaria papulis Lloyd

　　

内生真菌Xylaria papulis Lloyd从穿心莲（Andrographis paniculata Willd.，俗称绿色chiretta，原产于印度和斯里兰卡）的茎中分离得到。迄今为止，尚无关于使用组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase, HMT）抑制剂UNC1999对X. papulis进行表观遗传调控（epigenetic modulation）的报道。因此，本研究旨在评估该探针的独立效应。研究人员对真菌培养物进行了抗氧化（2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）和2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）自由基清除试验）和抗菌活性评估，针对六种人类病原体：表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 12223）、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-susceptible Staphylococcus aureus, MSSA ATCC 25923）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA MU50）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae ATCC 13047）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae ATCC 700603）和大肠杆菌（E. coli ATCC 25922）。从用250?nM UNC1999处理的样品中回收的粗提物，与对照组相比，对S. epidermidis (ATCC 12223)、MSSA (ATCC 25923)、MRSA (MU50)、E. cloacae (ATCC 13047)和K. pneumoniae (ATCC 700603)表现出增强的抗氧化和抗菌功效。使用气相色谱-质谱联用（gas chromatography–mass spectrometry, GC-MS）和超高效液相色谱-高分辨质谱联用（ultra-high-performance liquid chromatography with high-resolution mass spectrometry, UHPLC-HRMS）分析了处理组和未处理组粗提物的化学图谱。结果突出了UNC1999调节X. papulis中隐蔽代谢物（cryptic metabolites）合成的能力，显示出抗菌和抗癌潜力。本研究强调了进一步研究调控这些表观遗传调控代谢途径的分子机制的重要性。

内生真菌（endophytic fungus）因其能够产生结构多样的次级代谢产物而备受关注，但多数生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs）在实验室条件下处于沉默状态，限制了其生物合成潜力的挖掘。表观遗传修饰（epigenetic modification）如组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase, HMT）抑制剂可激活这些沉默基因，其中UNC1999作为EZH2/EZH1（zeste homolog 2/enhancer of zeste homolog 1）的特异性抑制剂，在微生物表观遗传学中展现出潜力。然而，目前尚无研究探讨UNC1999对Xylaria papulis Lloyd这一内生真菌中隐蔽代谢物（cryptic metabolites）的调控作用。本研究旨在通过代谢组学方法评估UNC1999独立处理对X. papulis次级代谢的影响，以揭示其激活隐蔽途径的能力，并增强抗菌和抗氧化活性。该研究发表在《Frontiers in Microbiology》。

研究人员采用的关键技术方法包括：真菌菌株的形态与分子鉴定（基于ITS和ACT基因序列的系统发育分析）；UNC1999溶液制备与浓度梯度处理（25–1000?nM）；次级代谢物的乙酸乙酯提取；抗菌活性测试（纸片扩散法，针对六种人类病原菌，菌株来源包括ATCC和MU50等标准菌株）；抗氧化活性评估（DPPH和ABTS⁺自由基清除法）；代谢物谱分析（GC-MS和UHPLC-Q-TOF-MS/MS）。所有实验均设置三次重复，统计采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD检验。

研究结果按原文小标题总结如下：

**3.1 Morpho-molecular identification（形态分子鉴定）**：经形态特征和分子分析（ITS和ACT基因）鉴定该菌株为X. papulis，系统发育树显示其与X. papulis 89021903 (HAST) 聚类，支持率≥100%，表明其进化位置明确。

**3.2 Antibacterial activity of both treated and untreated cultures（处理与未处理培养物的抗菌活性）**：250?nM UNC1999处理后的粗提物对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae ATCC 700603）、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA ATCC 25923）、阴沟肠杆菌（E. cloacae ATCC 13047）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA MU50）和大肠杆菌（E. coli ATCC 25922）的抑菌圈显著增大（^***p < 0.001），但对表皮葡萄球菌（S. epidermidis ATCC 12223）无抑制；其他浓度（25、50、100、500、1000?nM）处理组与对照组无显著差异。

**3.3 DPPH method（DPPH法）**：250?nM处理组的DPPH自由基清除活性达82.49%（对照组59.22%），EC₅₀值降至134.48?±?0.41?μg/mL（对照组278.93?±?0.48?μg/mL），表明抗氧化能力显著提升（p < 0.0001）。

**3.4 ABTS⁺ method（ABTS⁺法）**：250?nM处理组的ABTS⁺清除活性达85.77%（对照组65.2%），EC₅₀值降至108.40?±?0.377?μg/mL（对照组263.53?±?0.29?μg/mL），进一步验证了抗氧化增强（p < 0.0001）。

**3.5 Characterization of bioactive compounds（生物活性化合物表征）**：GC-MS分析显示，250?nM处理组诱导了环八硅氧烷（cyclooctasiloxane）、邻苯二甲酸己基丙酯（phthalic acid, hexyl propyl ester）、苯乙酸衍生物、9-十八碳烯酸甲酯（9-octadecenoic acid (Z)-, methyl ester）等化合物，而对照组及其他处理组未见这些峰。

**3.6 Identification of compounds by UHPLC-Q-TOF-MS/MS（UHPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定化合物）**：正离子模式下诱导了姜黄素（curcumin）、白藜芦醇-4'-O-葡萄糖苷酸（resveratrol-4'-O-glucuronide）、反式白藜芦醇（trans-piceatannol）、咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester）、根皮素（phloretin）、东莨菪内酯（scopoletin）、秦皮亭（fraxetin）、七叶内酯（esculetin）、香草醛（vanillin）、芥子酸（sinapinic acid）、麦黄酮（tricin）、原儿茶酸（protocatechuic acid）、紫草素（purpurogallin）、恩贝酸（embelin）、白花丹醌（plumbagin）、散沫花醌（lawsone）、丁香酚（eugenol）、愈创木酚（guaiacol）、氢醌（hydroquinone）、丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene, BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）、乙氧基喹（ethoxyquin）、α-生育酚（α-tocopherol）、尿石素B（urolithin B）、欧腺苷酮（euxanthone）、呫吨酮（xanthone）、穿心莲内酯（andrographolide）、土木香内酯（alantolactone）、莪术酮（turmerone）、桉叶油醇（eucalyptol）、柠檬烯（limonene）、反式肉桂醛（trans-cinnamaldehyde）、柠檬醛（citral）、己基间苯二酚（hexylresorcinol）、法尔卡里酮（falcarinone）、堆心菊内酯（helenalin）、去氢木香内酯（dehydrocostus lactone）、葫芦素P（cucurbitacin P）、布替萘芬（butenafine）、伏立康唑（voriconazole）、奥索利酸（oxolinic acid）、新生霉素酸（novobiocic acid）、红霉素乙基琥珀酸酯（erythromycin ethylsuccinate）、油酸（oleic acid）、棕榈油酸（palmitoleic acid）、花生四烯酸（arachidonic acid）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）等。负离子模式下诱导了开环异落叶松树脂酚（secoisolariciresinol）、丁香酚（eugenol）、没食子酸（gallic acid）、龙胆酸（gentisic acid）、东莨菪内酯（scopoletin）、桑酮（morusin）、环桑酮（cyclomorusin）、五味子素C（schisandrin C）、芥子醇（sinapyl alcohol）、3,4-二羟基苯乙酸（3,4-dihydroxyphenylacetic acid）、脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid）、高香草酸（homovanillic acid）、3,4-二羟基苯丙酮酸（3,4-dihydroxyphenylpyruvic acid）、放线菌素（actinonin）、硫藤黄菌素（thiolutin）、子囊霉素（ascomycin）、吡喹酮（pyochelin）等。这些化合物在对照组中未检测到，表明UNC1999处理激活了隐蔽途径。

讨论部分指出，250?nM UNC1999处理显著增强了X. papulis粗提物的抗氧化和抗菌活性，这归因于表观遗传激活了沉默的BGCs，导致多种具有抗氧化、抗菌、抗癌活性的化合物（如姜黄素、咖啡酸苯乙酯、没食子酸等）的诱导产生。UNC1999通过抑制H3K27me2/me3的甲基化，重塑染色质结构，上调聚酮合酶（PKS）、非核糖体肽合成酶（NRPS）等关键酶的表达，从而激活隐蔽代谢途径。研究结果与之前关于HMT抑制剂BRD4770增强Diaporthe longicolla抗氧化活性的报道一致，进一步支持了表观遗传调控在真菌代谢多样性中的重要作用。

结论部分翻译如下：本研究表明，利用组蛋白甲基转移酶抑制剂UNC1999进行表观遗传修饰是一种有效的技术，可解锁内生真菌X. papulis中隐蔽代谢物的合成。250?nM浓度的UNC1999处理X. papulis培养物被确定为触发生物活性隐蔽代谢物回收的有效浓度，从而增强抗菌和抗氧化特性。通过GC-MS和UHPLC-HRMS进行的代谢组学分析表明，许多具有已知抗氧化、抗菌、抗癌作用的生物活性化学物质被诱导，表明化学表观遗传修饰可以使真菌的代谢输出多样化。本研究证明了UNC1999在表观遗传靶点上的有效性，并能显著促进内生真菌X. papulis中沉默化合物的合成。UNC1999处理引起的组蛋白修饰水平变化可能进一步加深研究人员对精确过程的理解。