用于提取杨树蜂胶的甜菜碱基溶剂的合理开发

《Journal of Agriculture and Food Research》：Rational Development of Betaine based Solvents for the Extraction of Poplar Propolis

　　

蜂胶是蜜蜂基于植物来源的树脂状材料，具有多种健康益处。蜂胶的成分独特性使得蜂胶提取物的标准化具有挑战性，同时对替代传统溶剂的提取需求持续存在。本研究聚焦于甜菜碱（Betaine）基低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DES），其与乙二醇（Ethylene Glycol, EG）、丙二醇（Propylene Glycol, PG）和甘油（Glycerol, Gly）组合。利用COSMO-RS（Conductor-like Screening Model for Real Solvents）理论预测杨树蜂胶中模型化合物的溶解度，并设计具有最高溶解度的溶剂系统以提取五种不同的蜂胶样品。研究人员初步制备了七种低共熔溶剂，并从总酚含量（Total Phenolic Content, TPC）、抗氧化和抗菌潜力方面评估了提取效率。高效液相色谱（HPLC）分析表明，大多数制备的乙二醇和丙二醇基溶剂提取的黄酮类化合物超过其乙醇对应物的80%。甜菜碱的添加导致溶剂系统粘度增加，从而引起提取效率偏离预测模式。因此，研究人员对三种高粘度的低共熔溶剂——Betaine:Ethylene Glycol（1:3）、Betaine:Propylene Glycol（1:4）和Betaine:Glycerol（1:2）——系统地用5%、10%、20%和30%的水进行稀释，并用于提取。溶剂的水合作用不同程度地提高了Betaine:Ethylene Glycol（1:3）和Betaine:Propylene Glycol（1:4）的可提取性。该研究确定了使用甜菜碱基溶剂作为乙醇提取物可持续替代品的可能性。

**论文解读：基于甜菜碱的低共熔溶剂用于杨树蜂胶提取的合理开发**

**研究背景与问题提出**

蜂胶（Propolis）是蜜蜂从植物来源采集的树脂状物质，具有多种健康益处，如抗氧化、抗菌、抗炎等。然而，蜂胶的化学成分高度依赖于地理来源、当地植被、蜜蜂种类和采集季节，导致其成分复杂多变，超过850种化合物已被鉴定，而每种蜂胶通常含有80-100种化学成分。这种成分独特性使得蜂胶提取物的标准化极具挑战性。传统上，乙醇-水溶液（如70%乙醇）是最常用的提取溶剂，但存在若干缺点：当与水或水性环境接触时，疏水性成分会立即沉淀，导致生物活性降低；酒精提取物可能引起皮肤刺激和残留味道，且因文化、宗教或生理限制而不适合某些人群。水作为通用溶剂，由于蜂胶化合物的疏水性和树脂基质，无法有效提取。因此，迫切需要开发能够高效提取蜂胶关键化学成分并保持其生物活性的替代溶剂。

低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DES）因其良好的生物降解性、可调物理化学性质、热稳定性、低挥发性和低毒性而受到关注。DES由氢键受体（Hydrogen Bond Acceptor, HBA）和氢键供体（Hydrogen Bond Donor, HBD）按一定比例混合而成，形成熔点低于各组分的均相液体。本研究旨在开发基于甜菜碱（Betaine, Bet）的DES，作为70%乙醇的可持续替代品，用于提取杨树蜂胶，并评估其提取效率、抗氧化和抗菌活性。甜菜碱是一种天然、廉价、无毒的季铵盐，可作为HBA；而乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和甘油（Gly）作为HBD，提供多羟基网络。先前研究表明，黄酮类化合物是蜂胶抗菌活性的关键成分，因此本研究以黄酮类化合物（如白杨素、松属素和高良姜素）为模型化合物，进行系统筛选。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）**COSMO-RS理论预测**：利用导体类屏蔽模型（COSMO-RS）软件，预测模型化合物（白杨素、松属素、高良姜素）在不同Bet/HBD组合中的溶解度，通过计算无限稀释活度系数筛选出比纯乙醇溶解度更高的溶剂系统。2）**低共熔溶剂的制备与表征**：将Bet与EG、PG、Gly按特定摩尔比混合，在50℃下形成均相液体，并测定其极性（通过Nile红溶致变色染料）和表观pH。3）**蜂胶提取**：从波兰格但斯克附近5个不同养蜂场收集5种蜂胶样本（P1-P5），冷冻粉碎后以1:20（w/v）比例加入溶剂，在50℃、180 rpm振荡3小时提取，离心过滤后获得提取物。4）**提取效率评估**：通过总酚含量（Folin-Ciocalteu法）、抗氧化活性（DPPH自由基清除法）、抗菌活性（最小抑菌浓度MIC测定，针对金黄色葡萄球菌和念珠菌）、HPLC定量分析黄酮类化合物组成，以及粘度测量（流变仪）和绿色度评估（AGREEprep工具）。

**研究结果**

**1. COSMO-RS活度系数与σ-轮廓**
理论计算表明，添加甜菜碱提高了模型化合物在EG、PG、Gly中的溶解度，且溶解度随HBA含量增加而增加。基于活度系数，选择了7种在室温下保持液态的DES（Bet:EG 1:3、Bet:PG 1:4/1:5/1:6、Bet:Gly 1:2/1:3/1:4）。σ-轮廓分析显示，这些DES在非极性区和HBA/HBD区比70%乙醇具有更大面积，表明溶质-溶剂相互作用涉及范德华力、疏水作用和氢键。

**2. 极性与pH**
所有溶剂的极性（ENR值）接近70%乙醇（差异<3%），表观pH范围7.05-8.69，与70%乙醇（pH 7.12）相当，消除了pH作为混杂因素。

**3. 总酚含量与抗氧化潜力**
5种蜂胶提取物的TPC结果显示，添加甜菜碱提高了甘油基溶剂的酚类提取效率，但总体上，EG和PG基溶剂提取了超过60%的乙醇参考物酚类（除个别样品）。甘油基溶剂提取效率最低，但Bet:Gly (1:4)表现最佳（>70%）。抗氧化活性（IC50）方面，EG和PG基溶剂与乙醇提取物相当，甘油基溶剂IC50最高（活性最差），添加甜菜碱改善了甘油基溶剂的抗氧化能力。

**4. 抗菌活性**
所有提取物对测试菌株（C. albicans SC5314、C. glabrata DSM 11226、S. aureus ATCC 29213/25923）均表现出抑制活性，MIC值范围0.08-2.5% (v/v)。除甘油基溶剂外，其他DES提取物的MIC值与乙醇提取物相似。甘油添加甜菜碱后抗菌活性提高。PES 5对C. albicans的活性最弱，但对其余菌株有效。溶剂本身在测试浓度（2.5% v/v）下无抗菌活性，提示提取物与溶剂成分可能具有协同作用。

**5. HPLC分析**
从所有提取物中鉴定出16种黄酮类化合物。EG和PG基溶剂对某些蜂胶样品的黄酮提取效率高于乙醇，但添加甜菜碱后，EG和PG基溶剂的黄酮总量下降，归因于粘度增加；而甘油基溶剂添加甜菜碱后黄酮提取量增加20-30%。某些DES能提取到乙醇无法提取的微量成分（如异樱花素）。

**6. 粘度影响**
粘度测量表明，DES粘度远高于70%乙醇，且随Bet含量增加而升高。Bet:Gly (1:2)粘度最高。温度升高（从25°C到60°C）显著降低粘度，提取在50°C进行以改善传质。高粘度是导致EG和PG基DES提取效率低于理论预测的主要原因。

**7. 水合作用的影响**
对Bet:EG (1:3)、Bet:PG (1:4)、Bet:Gly (1:2)添加5%-30%水，降低了粘度并增加了极性。TPC结果显示，Bet:EG和Bet:PG在添加5%-20%水后TPC增加（部分样品超过乙醇参考），而Bet:Gly水合后TPC未提高。抗氧化活性方面，Bet:PG水合后IC50降低（活性提高），Bet:Gly水合后IC50升高。抗菌活性方面，水合导致Bet:EG和Bet:PG的MIC值增加0.5-2倍，而Bet:Gly水合后MIC增加2-4倍。HPLC分析表明，Bet:EG添加5%-10%水可提高黄酮提取量，但20%-30%水则降低；Bet:PG水合后黄酮提取量在一定范围内增加；Bet:Gly水合后黄酮含量持续下降。

**8. 绿色度评估**
使用AGREEprep工具评估，EG和乙醇因毒性被扣分，而甜菜碱、PG、Gly和水的使用提高了绿色度。PG和Gly基溶剂得分0.64，优于乙醇（0.42），表明其更可持续。

**结论与讨论**

本研究通过系统筛选，确定了基于甜菜碱的低共熔溶剂作为杨树蜂胶提取的可持续替代品。理论预测（COSMO-RS）与实验结果表明，甜菜碱的添加显著提高了甘油基溶剂的提取效率，但因粘度增加导致EG和PG基溶剂效率低于预期。水合作用可降低粘度并改善提取效率，但水合程度需针对每种溶剂系统优化。抗菌活性方面，提取物与溶剂成分可能协同作用，使得提取效率的波动对抑菌效果影响较小。PG和Gly基DES在提取效率和绿色度方面表现优异，适合用于未来蜂胶制剂的开发。结论指出，尽管蜂胶成分复杂，但合理设计的甜菜碱基DES能够高效提取黄酮类化合物且保持生物活性，为替代传统乙醇提取提供了可行方案。论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。