《Macromolecular Bioscience》：Modular Tissue-Engineered Motor Units Featuring Spinal Motor Neurons Innervating Self-Assembled Myofiber Bundles
编辑推荐：
运动单位是肌肉收缩的功能单位，由一个运动神经元的轴突末梢支配的一群骨骼肌纤维组成。组织工程策略正被用于通过模拟天然肌筋膜结构的方面来治疗神经肌肉损伤；然而，神经支配在肌纤维发育中的关键作用常被忽视。研究人员团队先前在纳米纤维片上开发了预神经支配的组织工程肌肉，
运动单位是肌肉收缩的功能单位，由一个运动神经元的轴突末梢支配的一群骨骼肌纤维组成。组织工程策略正被用于通过模拟天然肌筋膜结构的方面来治疗神经肌肉损伤；然而，神经支配在肌纤维发育中的关键作用常被忽视。研究人员团队先前在纳米纤维片上开发了预神经支配的组织工程肌肉，证明了神经支配在体外促进了肌纤维成熟和功能。当前研究在此基础上构建，以生物制造预神经支配的三维（3D）单个肌纤维束，更接近地复制体内结构。具体而言，研究人员建立了一种方法学来生成厘米级的组织工程运动单位（TEMUs），其包含在胶原水凝胶内排列的肌纤维束，并由来自离散脊髓运动神经元群体的轴突支配。一个定制的聚二甲基硅氧烷微尺度通道系统促进了成肌细胞的排列和自组装。与未神经支配的对照组相比，聚集的运动神经元和轴突整合显著增强了肌纤维成熟和收缩性。研究人员还评估了培养基成分对肌纤维成熟的影响，通过肌细胞融合和肌节形成来评估。重要的是，这种TEMU生物制造方案是完全可扩展的，可生成长度至少8厘米的模块化肌纤维束，这些肌纤维束可以平行排列以实现大规模肌纤维宏观束。TEMUs通过提供一个三维（3D）生物保真平台来研究神经支配在肌肉发育和功能中的作用，以及作为一种可植入的复合组织来促进严重创伤后的肌肉替代，从而解决了肌肉组织工程中的关键挑战。
**研究背景与问题**
神经支配在肌肉发育、功能和再生中起关键作用，例如运动轴突末梢与新生肌纤维耦合并分泌神经性agrin，促进神经肌肉装置的形成与稳定，同时轴突介导的神经肌肉接点（NMJ）激活进一步推动肌纤维成熟与功能化。然而，在组织工程中，神经支配这一关键因素常被忽视。严重损伤如体积性肌肉损失（VML）常伴随运动轴突切断，导致去神经支配的肌肉再生失败，尽管卫星细胞被激活，但肌生成不完整，无法产生正常肌纤维。现有肌肉组织工程策略（如纳米纤维支架）虽能模拟天然微结构，但难以扩展到人类尺寸的缺损，且缺乏细胞级拓扑和生化信号。因此，需要一种可重现肌束结构和细胞微环境、同时整合神经支配的可扩展工程组织。
**研究内容与结论**
研究人员开发了一种新型复合工程微组织——组织工程运动单位（TEMUs），由脊髓运动神经元群体支配的、在胶原水凝胶中排列的厘米级肌细胞束组成。通过定制聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道系统促进肌母细胞排列与自组装，并优化培养基成分（评估有丝分裂抑制剂的影响）。结果表明，与未神经支配的对照组相比，运动神经元聚集体和轴突整合显著增强了肌纤维成熟、收缩性、肌节形成和NMJ形成。重要的是，TEMU生物制造方案完全可扩展，可产生至少8厘米长的模块化肌纤维束，并可平行排列形成大规模宏观束。该论文发表在《Macromolecular Bioscience》。
**关键技术方法**
- 使用计算机辅助设计（CAD）和3D打印定制PDMS微通道模具，作为胶原水凝胶的外支架，促进肌细胞和轴突的排列与自组装。
- 从胚胎第16天Sprague-Dawley大鼠脊髓中分离原代脊髓运动神经元，并通过金字塔形微孔形成细胞聚集体。
- 采用C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞（商业来源ATCC CRL-1772），与运动神经元聚集体和胶原水凝胶混合后填入PDMS通道，形成微组织。
- 通过免疫荧光染色（如β-tubulin III、NF200、α-actinin、phalloidin、ChAT、bungarotoxin）和共聚焦显微镜进行形态学表征，扫描电子显微镜（SEM）观察表面微结构，并利用谷氨酸刺激评估收缩功能。
**研究结果**
**3.1 免疫细胞化学显示细胞架构**：通过共聚焦显微镜观察三种细胞构型（TEM、TEMU-uni、TEMU-bi），证实肌细胞和运动神经元在7天和21天培养中存活，轴突从聚集体向通道内肌细胞投射，胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性表明乙酰胆碱合成。
**3.2 超微结构分析显示外部形态**：SEM显示TEMU端点处神经元聚集体结构紊乱，神经-肌肉过渡区有轴突沿自排列胶原纤维延伸，通道区域呈现自排列条纹状纤维，与天然肌肉纤维排列相似。
**3.3 横截面证实三维性**：横截面免疫荧光显示神经元核（NeuN）与肌细胞核分离，体积渲染（3D）证明肌细胞和运动神经元在三维空间内自束聚。
**3.4 长TEMU证明可扩展性**：通过CAD修改通道长度，成功培养1、2、4、8厘米的TEMU，8厘米微组织中肌细胞和轴突沿全长延伸，表明无理论长度限制，可适应不同大小损伤。
**3.5 有丝分裂抑制剂影响非神经元细胞**：比较三种培养基配方（+/-有丝分裂抑制剂），发现抑制剂存在时肌纤维长度、长宽比和融合指数随时间增加，宽度不变；无抑制剂时肌纤维排列更紧密；神经支配在21天时显著提高肌纤维角度分布的各向异性。
**3.6 肌节存在衡量成熟度**：21天培养后，肌节在部分肌纤维中出现，无抑制剂条件下神经支配显著增加含肌节肌纤维比例（TEMU-uni vs TEM），肌节长度在1-4 μm之间，与文献一致。
**3.7 神经肌肉接头和收缩性证明功能性**：使用bungarotoxin染色在TEMU-uni和TEMU-bi中观察到自形成的NMJ，形态类似出生后肌肉；谷氨酸刺激诱导神经支配微组织产生节律性收缩（1.48±0.04次/秒，最大位移4.88±0.70 μm），非神经支配组无收缩，证明功能性NMJ形成。
**3.8 局限性**：模型仅含C2C12和胚胎大鼠运动神经元，缺乏施万细胞、内皮细胞等；胶原水凝胶不能完全模拟天然ECM刚度；约20-30%微组织塌陷；NMJ密度和定量收缩力未测量。
**3.9 新兴VML再生策略**：与现有3D组织工程肌肉（如使用支柱锚定）相比，TEMU采用自锚定凹槽结构，可移除并并行捆绑形成宏观肌肉，且ECM透明利于观察，比纳米纤维片更经济、仿生和模块化。
**3.10 未来方向**：未来可加入光遗传学可编程神经元、人iPSC、钙瞬变测量、电刺激和力测量，以推进临床转化。
**讨论与结论**
讨论部分指出，TEMU平台提供了可控的体外基础模型，但需加入支持细胞、更生理的ECM和定量功能检测以改进模型。结论部分翻译如下：
研究人员提出了生物制造厘米级神经支配3D束状肌纤维的方法，称为组织工程运动单位（TEMUs），其复制了体内结构。这些构建体由自组装、排列的肌纤维束嵌入3D胶原水凝胶中，并由来自离散脊髓运动神经元群体的轴突支配。在发育过程中，肌纤维呈现各向异性伸长和渐进融合。尽管神经支配未显著影响肌细胞形态，但运动神经元聚集体和轴突整合增强了肌节形成和肌纤维收缩性。神经支配使骨骼肌发育得以实现，表现为肌节和功能性NMJ的稳健存在。重要的是，TEMU生物制造可扩展，可产生至少8厘米长的模块化肌纤维束并组装成大规模宏观束。该工作扩展了先前在引导3D架构中工程化肌肉和轴突组织的努力。所得神经支配工程肌肉组织提供了3D生物保真体外平台，用于研究神经支配在肌肉发育、功能和损伤/疾病中的关键作用，并具有作为可植入复合组织促进严重创伤后宿主和移植物肌肉再神经支配和功能恢复的潜力。研究人员的创新贡献包括成功实现运动神经元和肌纤维的3D共培养、细胞来源的灵活性以及可扩展生物制造的验证。这些概念验证研究为推进3D神经支配肌纤维平台作为生物保真模型系统和可植入治疗组织奠定了基础。
