Yanoikuyae菌SG1株对4-异丙基硝基苯的微生物好氧降解

《Journal of Hazardous Materials》：Microbial Aerobic Degradation of 4-Isopropylnitrobenzene by Sphingobium yanoikuyae strain SG1

　　

摘要

4-异丙基硝基苯是一种硝基芳香族化合物，常被用作农药合成和化学制造中的中间体。尽管它可能存在环境持久性和生态风险，但关于4-IPNB的微生物降解途径至今仍不甚清楚。在本研究中，从巴西的一家农药制造厂分离出一种革兰氏阴性细菌，命名为 SG1菌株，因为它能够以4-IPNB作为唯一的碳、氮和能量来源。SG1菌株对4-IPNB的有氧降解过程中会释放亚硝酸盐，而中间产物捕获实验表明会有4-异丙基儿茶酚暂时积累。这些发现共同表明4-IPNB首先通过氧化脱硝和双羟基化反应转化为4-IPC。基因组学和转录组学分析进一步推测出几种可能催化这一初始反应的硝基芳烃双加氧酶。此外，4-IPC的后续代谢可通过间位和邻位裂解途径进行，在所测试条件下，细胞提取物酶检测显示以间位裂解为主。SG1菌株在非无菌土壤浆液微环境中也能降解4-IPNB，这说明它的降解能力不仅限于特定液体培养环境。本研究首次全面揭示了4-IPNB的微生物有氧降解过程，增进了我们对新型硝基芳香族污染物环境归趋的了解，同时也证明了SG1菌株在4-IPNB生物降解和去除方面的应用潜力。

引言

硝基芳香族化合物是多种化学中间体，被广泛用作农药、药品、除草剂、炸药和染料合成的原料[1]、[2]。这些化学物质由于意外泄漏、不当废物处理、人类活动以及其他有机化合物的转化而进入生物圈，因其毒性和持久性而带来生态和健康风险[2]。4-异丙基硝基苯（4-IPNB，又称4-硝基甲苯）是通过选择性硝化甲苯后再还原为4-异丙基苯胺而工业合成的[3]、[4]。这种关键中间体主要用于制造除草剂异丙隆[5]。由于产量大且应用广泛，4-IPNB已成为受污染环境中常见的污染物。

在化工企业附近的工业废水和地下水中经常检测到4-IPNB，巴西的受污染地区其浓度可达2–3毫克/升[6]、[7]。值得注意的是，一个中试规模的人工湿地系统未能完全去除4-IPNB[6]，这体现了该物质对传统修复方法的抗性。它在环境中的存在范围还扩展到了工业区之外，因为在香烟烟雾中也检测到了5.3纳克/支的浓度[8]、[9]。现有的安全信息表明，4-IPNB（4-硝基甲苯）若被吞食、接触皮肤或吸入都有害，在德国的水危害分类系统中属于高水危害物质（WGK3）[10]。鉴于其危害性以及在工业中的应用和在受污染环境中的出现，了解其微生物降解过程和环境归趋显得尤为重要。

微生物降解依靠专门的微生物来分解污染物，被视为去除硝基芳香族化合物的一种具有前景且可持续的方法[11]。多种细菌菌株具备降解4-IPNB多种结构类似物的能力。例如，从受污染环境中已分离出能够以硝基苯作为唯一碳、氮和能量来源的细菌，如Comamonas sp. JS765[12]、Arthrobacter sp. NB1、Serratia sp. NB2、Stenotrophomonas sp. NB3[13]以及Pseudomonas putida NB-1菌株[14]。多种硝基甲苯，从单硝基甲苯异构体（2-NT[15]、[16]，3-NT[17]，4-NT[18]）到二硝基甲苯（2,4-和2,6-二硝基甲苯[19]、[20]、[21]），都能被特定的Pseudomonas、Micrococcus、Rhodococcus和Acidovorax菌株生物降解。还有多种细菌菌株也被报道能够利用这些化合物作为唯一的碳、能量或氮源，包括用于2-氯硝基苯的P. stutzeri ZWLR2-1[22]、[23]和P. putida OCNB-1[24]，用于3-氯硝基苯和3-溴硝基苯的Diaphorobacter sp. JS3051[25]，用于4-氯硝基苯的Comamonas sp. CNB-1[26]、P. putida ZWL73[27]和Comamonas sp. LW1[28]，以及分别用于3,4-二氯硝基苯和2,3-二氯硝基苯的Diaphorobacter sp. JS3050和JS3051[29]、[30]、[31]。此外，作为4-IPNB的非硝基芳香族类似物，甲苯（异丙基苯）的细菌降解在多种Pseudomonas菌株中也有详细研究，比如P. putida F1[32]、P. putida RE204[33]以及P. fluorescens IP01[34]、[35]。

细菌主要通过两种不同的策略代谢硝基芳香族化合物：部分还原途径和氧化途径[2]。还原途径涉及逐步还原硝基，适用于硝基苯[36]和4-氯硝基苯[26]、[27]、[28]、[37]等底物。而氧化途径的独特之处在于，它最初通过多组分硝基芳烃双加氧酶催化的协同反应，一步直接释放出亚硝酸盐并形成取代儿茶酚[38]。这种儿茶酚中间体随后通过邻位或间位裂解途径进入核心代谢过程，从而实现完全矿化[38]。这种高效的氧化机制有助于降解多种硝基芳香族化合物[2]、[38]，包括硝基苯[39]、[40]、硝基甲苯[16]、[17]、[18]、二硝基甲苯[19]、[20]以及3-硝基苯甲酸[41]、[42]。有观点认为，尽管这些分解途径在不同地理区域的菌株中都有发现，但它们可能源自与Ralstonia sp. U2菌株中所发现的萘降解系统相似的祖先途径[38]、[43]、[44]。然而，尽管4-IPNB在环境中有重要意义且与上述硝基芳香族化合物结构相似，但目前尚未有能够降解4-IPNB的细菌菌株或其明确的生物降解策略被报道。

在本研究中，从巴西的一家农药制造厂分离出一种能够以4-IPNB作为唯一碳、氮和能量来源生长的细菌菌株。该菌株被鉴定为 SG1菌株。通过整合基因组学和转录组学数据以及生理学和生化数据，包括呼吸测定、酶活性检测以及亚硝酸盐释放和关键中间体4-异丙基儿茶酚的检测，我们确定了4-IPNB的分解途径。还在非无菌土壤浆液微环境中进一步评估了SG1菌株的降解能力。我们的研究首次报道了能够降解4-IPNB的细菌，从而为理解4-IPNB的生物降解过程提供了细菌模型和重要信息，也拓展了SG1菌株在非液体培养环境中的降解能力。

章节节选

化学品、培养基及细菌菌株

本研究使用的所有化学品纯度均不低于97%，均来自商业供应商，具体如下。除非另有说明，所有化学品均购自美国圣路易斯的Sigma-Aldrich Co., Ltd.。以下化合物的来源分别为：4-IPNB来自中国上海的Adamas Reagent Co., Ltd.；4-IPC来自美国马萨诸塞州波士顿的TargetMol Chemicals Inc.；3-异丙基儿茶酚则来自中国上海的Bide Pharmatech Co., Ltd.

无氮的

SG1菌株的分离与鉴定

经过选择性富集后，得到了一株能够以浓度高达500微摩尔的4-IPNB作为唯一碳、氮和能量来源的细菌菌株，即SG1菌株。SG1菌株的16S rRNA基因序列与 ATCC 51230^T（GenBank登录号：JH992904.1）的序列完全一致，在使用EzBioCloud 16S数据库（v.20250421）构建的系统发育树中也与该菌株紧密相连（见图S1）。通过平均核苷酸一致性分析

结论

本研究报道了 SG1菌株的分离，这是一种能够在有氧条件下以4-IPNB作为唯一碳、氮和能量来源的细菌菌株。通过结合呼吸测定、酶活性检测以及基因组学和转录组学分析，我们从分子层面了解了其背后的分解途径。所提出的降解途径始于一种潜在的硝基芳烃双加氧酶的作用，随后硝基以亚硝酸盐形式被去除，接着是芳香环的

环境意义

由于4-异丙基硝基苯被广泛用作化学中间体，因此经常在环境废水和地下水中被发现，而且它在烟草烟雾中的存在也凸显出其难以去除和可能导致广泛暴露的风险。鉴于其毒性，4-IPNB应被视为“危险物质”。

在本研究中，我们分离出了能够降解4-IPNB的细菌 SG1菌株，并通过综合分析研究了它的降解途径

CRediT作者贡献声明

周宁怡：写作——审阅与编辑，指导，资源提供，项目管理，资金获取，概念构思。李涛：写作——审阅与编辑，指导，项目管理，方法设计，概念构思。Jim C. Spain：写作——审阅与编辑，指导，资源提供，项目管理，方法设计，研究实施，资金获取，正式分析，概念构思。Blake G. Lindner：方法设计，研究实施，正式分析，数据整理。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了中国教育部基础学科拔尖计划（JYB2025XDXM906）、中国博士后科学基金会博士后 Fellowship项目（A类，BX20240226）、中国博士后科学基金会资助（2024M761950）以及Corteva Agriscience的支持。同时，我们也感谢Janet K. Hatt在技术上的帮助。

我们还要衷心感谢上海交通大学生命科学学院的核心设施与服务中心（CFSC）的

杨娜|伊莎贝尔·卡马拉|沙尔明·阿弗罗兹|纳塔娜·梅洛|萨维娅·加瓦扎|布莱克·G·林德纳|康斯坦丁诺斯·T·康斯坦丁尼迪斯|李涛|Jim C. Spain|周宁怡

中国上海交通大学微生物代谢国家重点实验室、代谢与发育科学国际联合实验室以及生命科学及生物技术学院，上海，中国