内皮细胞蛋白作为Susac综合征的生物标志物

《Annals of Clinical and Translational Neurology》：Endothelial Cell Proteins as Biomarkers in Susac Syndrome

　　

目的：Susac综合征（SS）是一种罕见的CD8⁺ T细胞介导的微血管病，累及脑、视网膜和听觉迷路。内皮损伤被认为是核心机制；然而，目前尚无已知的循环疾病生物标志物。研究人员进行了靶向蛋白质组学分析，以鉴定循环内皮相关蛋白作为SS的生物标志物。

方法：采用数据非依赖采集质谱（DIA-MS）分析4例确诊或可能SS患者及8例健康对照的血清。分析局限于具有已知内皮细胞表面或膜关联的蛋白质，并使用基于检测（Fisher精确检验）和定量（概率性缺失分析）模型评估差异丰度。

结果：六种内皮相关蛋白在SS中表现出差异丰度（未校正分析p?
结论：研究人员的发现提示内皮细胞表面或膜上的循环蛋白可作为SS的潜在生物标志物，并支持内皮功能障碍作为核心疾病机制。这项初步研究为在更大规模、纵向队列中进行验证提供了依据。

试验注册：ClinicalTrials.gov，NCT00001248和NCT02435810

**研究背景、问题与目的**
Susac综合征（SS）是一种罕见的自身免疫性微血管病，临床表现为脑病、视网膜分支动脉闭塞和感音神经性耳聋三联征。由于疾病常以不完全症状和复发形式呈现，诊断可能延迟，导致永久性神经、视觉和听觉残疾。目前认为，SS涉及细胞毒性CD8⁺ T细胞靶向主要器官的微血管内皮细胞。多项观察支持内皮功能障碍为核心机制，包括视网膜动脉壁斑块和荧光血管造影上的渗漏，以及钆增强后T2-FLAIR磁共振成像（MRI）显示的弥漫性内皮通透性特征。然而，目前尚无确立的循环生物标志物可用于SS。抗内皮细胞抗体在致病性或诊断相关性方面表现不一致，而先前的免疫印迹研究虽鉴定了SS相关蛋白条带，但其精确分子鉴定仍未明确。研究人员旨在确定内皮细胞表面或膜相关蛋白能否作为循环生物标志物，以区分SS病例与健康对照。为此，研究人员开展了基于质谱的血清蛋白质组学分析，将比较聚焦于预先定义的、在脑、视网膜和迷路微血管中具有明确表达的内皮相关蛋白组。

**主要关键技术方法**
本研究采用前瞻性收集的样本和临床数据，来源于美国国立卫生研究院（NIH）两项机构审查委员会批准的自然史研究方案（ClinicalTrials.gov标识符：NCT00001248和NCT02435810）。所有参与者均签署书面知情同意书。纳入符合SS诊断标准的参与者。蛋白质组学分析对SS病例和健康对照的血清进行，经细胞外囊泡富集后，采用高分辨率Orbitrap平台进行数据非依赖采集质谱（DIA-MS）分析。使用Spectronaut软件基于UniProt人类参考蛋白质组（UP000005640）进行蛋白质鉴定和定量，下游处理采用Protpipe。根据研究假设，从非过滤蛋白质组中筛选出与脑、视网膜和迷路微血管内皮细胞表面和膜已知关联的蛋白质。数据采用两阶段框架分析：首先用Fisher精确检验比较组间检测频率，再用概率性缺失分析（在线性模型框架内模拟强度依赖性缺失值）评估蛋白质丰度的定量差异。两种分析结果通过求和每个分析的–log₁₀转换p值整合为优先评分。

**研究结果**
**3 结果**
三个病例为确诊SS，一个为可能SS，具有特征性表现，包括脑MRI上中央胼胝体病变和钆增强后T2-FLAIR软脑膜强化，荧光血管造影上毛细血管无灌注和动脉壁高荧光，以及感音神经性耳聋。血清样本在疾病病程的不同时间点采集，距症状发作的中位间隔为7.1个月，距最近一次发作的中位间隔为4.1个月。所有患者均曾接受急性免疫治疗，采样时的治疗状态各异，部分病例接受维持免疫抑制。经内皮过滤后，在血清中定量了59种内皮表面或膜相关蛋白。定性分析（Fisher检验）未发现组间检测频率差异。考虑强度依赖性缺失的定量分析鉴定出六种内皮相关蛋白在SS与对照间存在名义丰度差异（图2）。低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）升高（log2倍数变化?=?+2.19，p?=?0.0059），而Nectin细胞黏附分子2（NECTIN2；?1.89，p?=?0.0195）、黑色素瘤细胞黏附分子（MCAM；?1.76，p?=?0.0237）、溶质载体家族27成员4（SLC27A4；?1.55，p?=?0.0218）、P-选择素（SELP；?1.55，p?=?0.0153）和白细胞介素-6信号转导子（IL6ST；?1.38，p?=?0.0213）降低。经多重检验校正后，无蛋白质达到显著性。整合定性和定量分析的联合排名指标未改变候选蛋白的优先顺序。

**讨论与结论**
在这项探索性蛋白质组学研究中，研究人员鉴定了六种血清内皮细胞相关蛋白在SS病例与健康对照间存在差异。尽管校正多重检验后未达到统计学显著性，反映了样本量有限和研究的探索性，但这六种候选蛋白与SS病理学具有一致性，并支持其生物学合理性。这些蛋白的功能涉及内皮完整性、白细胞-内皮细胞相互作用或炎症信号传导，从而反映了SS中观察到的内皮损伤和屏障功能障碍。值得注意的是，这些信号是在大多数病例处于非急性期且已接受免疫治疗后检测到的，提示它们可能反映持续的内皮改变而非短暂炎症反应。最显著的发现是循环低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）升高，这是一种多功能内皮受体，通过调节TGF-β信号、蛋白酶清除和紧密连接完整性维持血管稳定性。实验性内皮LRP1缺失会破坏血脑屏障结构并增加通透性，提示观察到的升高可能反映对内皮损伤的代偿反应或血管修复，而非原发性致病激活。相反，几种黏附分子和信号分子——包括黑色素瘤细胞黏附分子（MCAM）、Nectin细胞黏附分子2（NECTIN2）和P-选择素（SELP）——降低。MCAM（CD146）调节内皮通透性和白细胞迁移，在活动性炎症性血管病中升高。循环MCAM降低可能反映治疗后内皮活化的抑制或活化内皮细胞在受累微血管内的隔离。NECTIN2是一种参与屏障完整性和免疫检查点相互作用的连接黏附分子，可能同样反映恢复期疾病中内皮-免疫细胞串扰的改变。白细胞介素-6信号转导子（IL6ST；gp130）降低，即白细胞介素-6受体复合物的信号转导亚基，激活JAK–STAT信号，提示细胞因子驱动的内皮活化通路可能受到调节，可能继发于免疫抑制治疗。SLC27A4在SS中的作用尚不明确，但可能与炎症期间内皮代谢应激反应有关。一个重要的未解决问题是这些内皮细胞蛋白变化是否为Susac综合征所特有，还是代表炎症性血管病中内皮损伤的共享反应。本研究未设计解决疾病特异性问题，因为缺乏原发性中枢神经系统血管炎或系统性血管炎的比较队列。此外，蛋白表达可能随疾病阶段、治疗暴露和持续性内皮损伤程度而变化。因此，前瞻性研究应纳入标准化纵向采样以及血管炎和其他炎症性中枢神经系统比较队列，以区分疾病特异性生物标志物与更广泛的内皮活化、损伤或修复标志物。其他局限性包括队列规模小，大多数病例在临床稳定期或治疗期采样，可能减弱了疾病相关信号并限制了这些蛋白作为未治疗疾病诊断生物标志物的效用；脑脊液样本不足以进行正式分析，限制了区室特异性结论。因此，这些发现应视为假设生成性，需进一步验证。尽管如此，结果支持循环内皮细胞相关蛋白可能反映SS中疾病相关血管生物学这一概念。急性期和治疗期的纵向采样，以及与其他炎症性中枢神经系统疾病的比较，对于确定疾病特异性和机制相关性至关重要。

**结论翻译**：研究人员的发现提示内皮细胞表面或膜上的循环蛋白可作为SS的潜在生物标志物，并支持内皮功能障碍作为核心疾病机制。这项初步研究为在更大规模、纵向队列中进行验证提供了依据。