《Microchemical Journal》：Development and validation of a novel candidate reference procedure for the quantification of 3-nitro-L-tyrosine, 3-monoiodo-L-tyrosine and 3,5-diiodo-L-tyrosine in urine by isotope dilution and LC-ESI-MS/MS
编辑推荐：
•尿液中3-硝基-L-酪氨酸、3-单碘代-L-酪氨酸以及3,5-二碘代-L-酪氨酸的定量检测。•用于同位素稀释定量的13C和15N标记类似物。•氘代肌酐可用来原位测定肌酐含量。•该检测方法已依据临床与实验室标准协会的标准进行验证。•日间变异范围为0.8%至2.5%，日内变异范围为
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尿液中3-硝基-L-酪氨酸、3-单碘代-L-酪氨酸以及3,5-二碘代-L-酪氨酸的定量检测。
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用于同位素稀释定量的13C和15N标记类似物。
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氘代肌酐可用来原位测定肌酐含量。
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该检测方法已依据临床与实验室标准协会的标准进行验证。
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日间变异范围为0.8%至2.5%，日内变异范围为0.7%至4.2%。
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NT、MIT和DIT的检测准确度分别为103±6%、97±4%、95±5%。
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对1062份孕妇及其子女的尿液样本进行了分析。
引言
先天性甲状腺功能减退症是可预防的智力障碍病因之一。该病症表现为甲状腺激素生成不足，而碘是合成甲状腺激素的关键元素[1]。为确保有足够的碘用于甲状腺激素的合成，甲状腺演化出了两种特殊机制：一种是在甲状腺细胞中积累碘，另一种则是通过脱碘作用回收3-单碘代-L-酪氨酸和3,5-二碘代-L-酪氨酸中的碘[2]。碘酪氨酸脱卤酶1是负责脱碘并回收碘的甲状腺酶。若该酶功能异常，就会导致碘酪氨酸脱碘酶缺乏症，其表现包括甲状腺功能减退、甲状腺肿大以及大脑发育异常等问题[3]。这样一来，甲状腺内的碘酪氨酸浓度上升，进入血液后最终通过肾脏排出体外[4]。
碘缺乏和碘过量都会引发甲状腺的氧化应激反应[5][6]。在氧化环境下，酪氨酸的芳香环C3位置的氢会被硝基取代，从而形成硝基酪氨酸。这种变化既可能发生在游离酪氨酸上，也可能发生在多肽序列中的酪氨酸上。人体组织与体液中3-硝基-L-酪氨酸的出现与多种伴有严重炎症的疾病相关。在炎症状态下，过氧亚硝酸盐和髓过氧化物酶系统这两种主要的硝化因子会被激活，这说明3-硝基-L-酪氨酸可作为临床研究中氧化应激的标志物[7][8]。
由于DEHAL1酶功能异常，患有明显甲状腺功能减退症的患者体内会出现较高水平的MIT和DIT[3]。因此，准确测定尿液中的MIT和DIT含量，可用于诊断因碘酪氨酸脱碘酶缺乏引起的甲状腺功能减退症。此外，测定尿液中的3-硝基-L-酪氨酸含量对于研究DEHAL1酶功能异常与氧化应激之间的关系也具有重要意义。
目前尚无针对尿液样本中3-硝基-L-酪氨酸、MIT和DIT（其化学结构见图S1）的标准化定量方法。这些物质可通过毛细管电泳或ELISA免疫分析法进行检测。尽管免疫分析法成本较低且操作简单，但其特异性和灵敏度远低于与质谱联用的色谱技术[8][9]。若要使用气相色谱-质谱法测定这些物质，需先通过衍生化处理提高其挥发性[10]。而采用紫外检测器的液相色谱法则无法为复杂样本中的这些物质提供足够的检测选择性[11]。对于在临床样本这类复杂基质中检测低浓度代谢物的标准方法，是液相色谱-串联质谱法[12]。结合同位素稀释技术的LC-MS/MS被视为实验室医学中检测临床生物标志物的黄金标准方法，包括那些与甲状腺激素研究相关的标志物[13][14]。
同位素稀释质谱法能够提供具有最高计量准确度的检测结果，因为它属于可直接与国际单位制中“物质的量”概念相对应的基准方法[15][16]。该技术能够有效消除电喷雾源中因基质效应导致的离子化抑制现象。通过加入衍生化试剂提升这些物质的柱保留时间，并增强其离子化程度，可进一步优化LC-MS/MS法对3-硝基-L-酪氨酸、MIT和DIT的检测效果，从而使峰形更佳、检测限更低[17][18]。可通过在酸性环境中让酪氨酸衍生物的羧基与丁醇发生费希尔酯化反应，生成相应的酯类。不过，这种处理方式可能会导致基质中的游离酪氨酸被硝化，进而产生3-硝基-L-酪氨酸[19]。另外，还可利用同位素稀释质谱法测定每份尿液样本中的肌酐含量，从而将检测结果与样本中的肌酐水平相对关联。
本文介绍了首个用于同时测定尿液样本中3-硝基-L-酪氨酸、MIT和DIT的候选参考方法。该方法结合了同位素稀释技术以及配备电喷雾离子源的液相色谱与串联质谱技术。该方法的验证工作是按照临床与实验室标准协会的规定开展的。通过分析1062份孕妇及其子女的尿液样本，评估了这些生物标志物在早期诊断和治疗普通人群中的妊娠期或先天性甲状腺功能减退症方面的应用潜力。
章节要点
试剂与材料
肌酐的天然丰度标准品纯度为99.8±0.2%，3-硝基-L-酪氨酸纯度为100%，3-单碘代-L-酪氨酸纯度为98%，均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司；3,5-二碘代-L-酪氨酸纯度为100%，购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Scientific公司。2H3-肌酐（D3Cn，纯度98%）的同位素标记标准品则分别从法国圣奥班的Eurisotop公司和美国马萨诸塞州特克斯伯里的Cambridge Isotope Laboratories公司获得。15N1-MIT和13C2-DIT的同位素标记版本则是由Selective公司提前合成的
蛋白质沉淀步骤及进样量的优化
图1显示了在实验部分所述的优化条件下，含有约1μg·mL?1的Cn、3-硝基-L-酪氨酸、MIT和DIT的血清样本的LC-ESI-MS/MS色谱图。此时这四种物质的保留时间分别为0.37分钟、6.22分钟、6.78分钟和7.88分钟。由于肌酐分子结构中不存在羧基，因此无需进行衍生化处理，因其高极性缘故会在死时间处出峰。尽管肌酐在样本中的含量很高，但其信号强度
讨论
我们提出了首个基于同位素稀释技术结合液相色谱-串联质谱法的尿液样本中3-硝基-L-酪氨酸、MIT和DIT检测的候选参考方法。该方法的检测结果已按照CLSI标准进行验证，结果令人满意。该方法能够准确且精确地测定尿液样本中的这三种物质，无需额外的方法学校准，即可得到可直接与国际单位制标准相对应的检测结果
结论
我们在此开发了一种可用于同时测定尿液中3-硝基-L-酪氨酸、MIT和DIT的候选参考方法。据我们所知，这是首个依照CLSI标准经过验证的用于检测这些物质的方法。该方法的性能足以用于常规检测方法的评估与标准化，同时也能确保在检测个体患者样本中的这三种目标物质时具备准确的量化能力。
该方法
CRediT作者贡献说明
Helí Potes-Rodríguez：撰写原始草稿、方法学设计、实验实施、数据整理、概念构思。 Pablo Rodríguez-González：负责文章审阅与编辑、项目管理、方法学设计、实验实施、资金申请以及概念构思。 Juan Manuel Marchante-Gayón：参与文章审阅与编辑、方法学设计。 Pouya Alikhani：负责文章审阅与编辑、实验监督以及资源协调工作。 Mònica Guxens：参与文章审阅与编辑、资源协调、项目管理以及资金申请工作
利益冲突声明
所有作者声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
Helí Potes Rodríguez感谢西班牙阿斯图里亚斯亲王国通过Severo Ochoa奖学金（编号BP22-072）提供的财政支持。各位作者还感谢西班牙科学与创新部通过MCIU-22-PID2021-125795NB-I00和PID2024-159562NB-I00项目提供的资助。此外，这项研究还得到了西班牙卡洛斯三世健康研究所通过授予José C. Moreno的AES PI22/01375项目的支持。我们还要感谢其他相关资助方的帮助
Helí Potes-Rodríguez|Pablo Rodríguez-González|Juan Manuel Marchante-Gayón|Pouya Alikhani|Mònica Guxens|Anne-Claire Binter|Alireza Mani|José C. Moreno|José Ignacio García Alonso
