《Multiple Sclerosis and Related Disorders》：Sex-stratified blood transcriptomic candidate biomarkers of multiple sclerosis identified by ensemble feature selection
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摘要多发性硬化症在发病率、疾病进展、免疫反应及病情发展等方面存在性别差异，这表明性别会影响与疾病相关的分子机制。然而，由于数据异质性、高维度以及样本量有限，要找到可靠的性别特异性分子标记仍面临挑战。本研究旨在利用全血基因表达数据、经性别分层的转录组分析以及集成特征选择方法，寻找潜
摘要 多发性硬化症在发病率、疾病进展、免疫反应及病情发展等方面存在性别差异，这表明性别会影响与疾病相关的分子机制。然而，由于数据异质性、高维度以及样本量有限，要找到可靠的性别特异性分子标记仍面临挑战。本研究旨在利用全血基因表达数据、经性别分层的转录组分析以及集成特征选择方法，寻找潜在的性别特异性多发性硬化症生物标志物。研究分析了85例未经治疗的复发型多发性硬化症患者和60名健康对照者的全血基因表达数据，并通过两个独立的外部数据集对结果进行了部分验证。研究采用了集成特征选择方法和随机森林递归特征消除法来识别可靠的候选生物标志物，同时运用k折交叉验证来评估机器学习模型的性能。最终发现了女性特异性、男性特异性以及与性别无关的生物标志物集合，其中性别特异性标志物具有很强的区分能力（AUC-ROC值在0.822至0.865之间），有助于对多发性硬化症进行分子层面分类。此外，研究还进行了探针与基因的对应分析，以及基因集富集分析和基因与药物关联分析，以便从生物学和治疗角度了解与多发性硬化症相关的基因，同时考虑性别差异。有一些此前未被充分研究的与性别无关的基因（如TMEM258、CHMP2A、NDUFB4和TOMM22），以及性别特异性的基因（男性为CFD、SLPI和SAMD12，女性为TMEM176B和HLA-DRB5），被认定为有潜力作为进一步研究的诊断生物标志物。这些性别特异性标志物凸显了生物性别在多发性硬化症生物标志物发现中的重要性，同时也表明基于血液的生物标志物有望提升疾病的分类精度。
引言 多发性硬化症是一种复杂的自身免疫性疾病，会导致中枢神经系统出现慢性损伤。在复发型多发性硬化症中，炎症发作会引发脱髓鞘和轴突损伤，进而导致神经元功能逐渐受损并出现残疾（Reich, 2018）。性别会影响多发性硬化症的发病风险（Bianco等人，2023）、疾病进展速度（Bianco等人，2023；Voskuhl, 2020）以及治疗反应（Magyari等人，2014），这说明可能存在性别特异性的分子机制和生物标志物特征，而这些特征在综合分析中可能会被掩盖（Purnamawati等人，2018）。
近期的研究指出，血液和脑脊液中的生物标志物可以补充临床检查和磁共振成像在多发性硬化症诊断中的应用（Chitnis等人，2025）。基于血液的基因表达生物标志物是一种极具前景的无创诊断工具（D’Ambrosio等人，2015），也可用于监测治疗效果（Nickles等人，2013），不过目前还没有哪种标志物能够达到足以在临床中常规使用的标准（D’Ambrosio等人，2015；Holm Nielsen等人，2024）。外周血具有重要的生物学意义，因为它能够反映全身性的免疫活动以及与疾病相关的转录变化，包括与血脑屏障功能障碍和免疫细胞浸润相关的细胞外基质相关过程（Holm Nielsen等人，2024）。
由于多发性硬化症的临床表现和分子特性存在较大差异，加之转录组数据维度较高且样本量有限，要找到可靠的分子生物标志物是一项艰巨任务。尽管机器学习方法已被广泛用于多发性硬化症的分类和生物标志物发现（Fathimath和Syed，2024；Vázquez-Marrufo等人，2023），但大多数研究都侧重于提升预测性能，而非确保所选特征的稳定性和可重复性（Omrani等人，2024）。此外，此前的转录组研究虽然也发现了潜在的多发性硬化症生物标志物，但大多仅使用了单一的特征选择方法，且研究队列没有进行性别分层（Dixit等人，2023）。将不同的统计和机器学习特征选择方法应用于基因表达数据集时，往往得到的基因集不一致且重叠度低，这限制了所识别生物标志物的可重复性、生物学解释性以及临床应用价值。虽然已有研究将集成方法用于多发性硬化症分子标志物的筛选和诊断优化（Armananzas等人，2009；Torkey和Belal，2022；Zhao等人，2019），但这类方法与性别分层转录组分析的结合仍然较为有限。目前关于性别相关分子差异的大多数证据都来自系统评价和元分析（Purnamawati等人，2018；Catalá-Senent等人，2023）。从方法学角度来看，采用性别分层的共识特征选择方法可以减少转录组数据中的生物学差异，从而更有效地检测出那些在综合分析中可能被忽视的相关生物标志物。
为应对这些挑战，我们设计了一种基于六种经过精心挑选的特征筛选器和机器学习方法的混合集成特征选择框架，该框架专为高维度、低样本量的分子数据设计，用于识别多发性硬化症的候选转录组生物标志物，包括性别特异性标志物。通过整合多种特征选择方法的信息，该方法能够提升结果的稳定性，减少方法带来的偏差，提高所选特征的可靠性。
与以往的研究相比，我们的工作将性别分层的转录组分析与集成特征选择方法相结合，从而同时解决生物学差异和方法学不稳定性问题。本研究的主要贡献如下：
• 分析了来自复发型多发性硬化症患者（男性和女性）全血样本的转录组数据，以及对应的健康对照组的数据；
• 通过混合集成特征选择方法结合随机森林递归特征消除法，找到了男性特异性、女性特异性以及与性别无关的候选生物标志物；
• 采用基于随机森林的监督机器学习方法，并通过多次k折交叉验证，评估了Top-N候选生物标志物的预测性能；
• 通过两个独立的数据集对结果进行了部分外部验证；
• 运用KEGG和GSEA工具包进行了功能富集分析；
• 进行了基因与药物关联分析，为这些生物标志物的潜在治疗应用提供初步依据。
章节节选 数据收集 本研究使用的是从ArrayExpress数据库中获取的、针对复发型多发性硬化症患者的全血样本的基因表达数据（Affymetrix GeneChip Human Exon 1.0 ST Array），相关数据编号为E-GEOD-41850（
E-GEOD-41850 ）。这些数据之前已经有过描述，也通过Nickles等人（2013）提出的统计方法进行分析过，尤其是针对干扰素治疗的相关研究。研究中仅纳入了未经治疗的多发性硬化症患者，样本选择的详细信息见补充材料。
性别相关的生物标志物 通过集成特征选择方法，在MSC.F CV数据集中发现了3101个相关探针，在MSC.M CV数据集中发现了807个相关探针，这表明女性组和男性组的特征空间存在显著差异。所发现的生物标志物在特征选择方法类型以及重采样后的特征集方面都呈现出高度多样性，反映出所选子集之间存在较大的差异性。之后，在完成探针与基因的对应映射后，又在基因层面进行了进一步分析。
讨论 女性组和男性组中存在的共有生物标志物表明，多发性硬化症存在一种核心的、基于血液的转录特征。研究中检测到了与多发性硬化症密切相关的基因HLA-DRB1，这一结果证明了该分析框架的生物学合理性，也与免疫相关通路在多发性硬化症发病机制中的核心作用相一致（Caillier等人，2009；Catalá-Senent等人，2023）。此外，其余的共有候选基因可能反映了疾病相关的常见免疫和细胞应激机制。
结论 总之，本研究证明，采用性别分层的混合集成特征选择方法，是识别与复发型多发性硬化症相关的、具有较强分析稳健性和生物学合理性的血液转录组候选生物标志物的有效手段。尽管研究数据具有高维度、样本量少的特点，但所采用的特征选择框架依然能够识别出具有较强区分能力的性别特异性和与性别无关的候选生物标志物，这一点从该类标志物较高的分类性能中就可以看出来。
CRediT作者贡献说明 Aneta Polewko-Klim： 撰写——初稿撰写、可视化分析、验证、软件应用、项目管理、方法设计、实验开展、正式分析、数据整理、概念构思。Natalia Wawrusiewicz-Kurylonek： 撰写——初稿撰写、正式分析。
资金支持说明 本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何特定资助。
利益冲突声明 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
Aneta Polewko-Klim|Natalia Wawrusiewicz-Kurylonek
波兰比亚韦斯托克大学计算机科学学院，Cio?kowskiego 1M街，比亚韦斯托克，15-328
