KLF4与围手术期神经认知障碍及SMAD7相关的氧化应激和铁死亡相关信号

《Neuroscience Research》：KLF4 is associated with perioperative neurocognitive disorder and SMAD7-linked oxidative stress and ferroptosis-related signaling

　　

KLF4与围手术期神经认知障碍（PND）及SMAD7相关的氧化应激和铁死亡相关信号有关。•KLF4在麻醉和手术后海马中上调。•KLF4敲低减轻认知损伤和神经元损伤。•KLF4敲低减轻氧化应激和铁死亡标志物。•KLF4直接结合SMAD7启动子激活其转录。

论文解读文章

围手术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive disorder, PND）是老年患者围手术期常见的神经系统并发症，表现为麻醉和手术后记忆、注意力、学习及执行功能损伤。现有证据表明，PND并非单一致病事件，而是由神经炎症、氧化应激、血脑屏障破坏、突触功能障碍及神经元损伤等多重机制相互作用所致。其中，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖的调节性细胞死亡形式，因脂质过氧化和抗氧化防御系统（尤其是SLC7A11/GSH/GPX4轴）崩溃而驱动，近年来被证实参与PND及七氟烷相关神经毒性。然而，上游转录调控因子尚未明确。Krüppel样因子4（KLF4）是一种锌指转录因子，在神经系统损伤中发挥调控作用，但它在PND中的角色，尤其是与氧化应激和铁死亡的关系，仍不清楚。此外，抑制性Smad蛋白SMAD7（Mothers against decapentaplegic homolog 7）可拮抗转化生长因子-β（TGF-β）信号，并已被报道参与术后记忆障碍。KLF4与SMAD7在非神经系统中存在功能交互，但在神经系统中是否通过该轴促进PND，尚待阐明。因此，研究人员假设KLF4通过转录调控SMAD7，促进海马神经元氧化应激和铁死亡相关信号，从而参与PND发病。该研究旨在验证这一假设，并提供实验证据。论文发表在《Neuroscience Research》。

研究人员开展的研究包括：采用10-12月龄雄性C57BL/6J小鼠（来源：Charles River实验室，北京）建立PND模型（七氟烷麻醉下开放性胫骨骨折内固定术），通过海马立体定位注射携带shRNA的腺相关病毒（AAV-shKLF4）实现KLF4敲低，术后3-12天进行Morris水迷宫、新物体识别和Y迷宫行为学测试；收集海马组织进行Nissl染色、免疫组化、免疫荧光、RT-qPCR、Western blot及铁含量、氧化应激指标（MDA, GSH, T-AOC, SOD, CAT, GPX）检测；体外使用HT22小鼠海马神经元细胞系，暴露于4%七氟烷6小时建立损伤模型，通过转染shKLF4或过表达质粒调控KLF4，检测细胞活力、凋亡、ROS、脂质过氧化、铁代谢相关蛋白；利用hTFtarget和JASPAR数据库预测KLF4靶基因，通过ChIP和双荧光素酶报告基因实验验证KLF4对SMAD7启动子的直接结合和转录激活；采用药理学抑制剂Z-VAD-FMK（泛caspase抑制剂）和ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）区分凋亡与铁死亡贡献。主要关键技术方法包括：动物模型建立（PND模型）、病毒介导的基因沉默、行为学评估、组织学分析、细胞培养与处理、分子生物学技术（RT-qPCR、Western blot、ChIP、双荧光素酶）、氧化应激和铁死亡相关生化检测、流式细胞术。样本队列来源：小鼠购自查尔斯河实验室（北京），HT22细胞购自Merck Millipore。

研究结果：

**3.1 KLF4在麻醉和手术后海马神经元中上调**
RT-qPCR和Western blot显示，手术组（surgery）海马KLF4 mRNA和蛋白水平显著高于对照组。免疫荧光共染NeuN发现，KLF4在CA1和CA3区神经元中荧光强度增强，而齿状回（DG）无明显变化。

**3.2 KLF4敲低与麻醉和手术后认知损伤减轻相关**
AAV-shKLF4注射显著降低手术诱导的KLF4上调。Nissl染色显示，手术组CA1和CA3区Nissl阳性神经元减少，shKLF4处理部分恢复。行为学测试：Morris水迷宫训练期，shKLF4组逃逸潜伏期缩短，探索期目标象限停留时间和平台穿越次数增加；新物体识别测试中，shKLF4组辨别指数提高；Y迷宫自发交替率升高。表明KLF4敲低可改善PND小鼠的认知功能。

**3.3 KLF4敲低减轻麻醉和手术后神经元铁死亡相关标志物变化和氧化应激**
手术组海马铁含量升高，shKLF4处理显著降低；氧化应激指标：MDA升高，GSH、T-AOC、SOD、CAT、GPX降低，均被shKLF4逆转；caspase-3活性升高也被抑制。Western blot显示手术组GPX4和SLC7A11表达下降，shKLF4恢复其表达；免疫组化证实GPX4阳性染色在CA1和CA3区减少，shKLF4减轻此变化。

**3.4 KLF4敲低减轻七氟烷诱导的HT22细胞氧化应激**
shKLF4转染后，七氟烷暴露的HT22细胞中ROS（DHE染色）降低，MDA和LDH减少，GSH、T-AOC、SOD、CAT、GPX水平恢复；4-HNE免疫荧光强度降低。

**3.5 KLF4敲低减轻七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡相关变化**
CCK-8和EdU显示七氟烷降低细胞活力和增殖，shKLF4逆转；流式细胞术显示凋亡率降低，caspase-3活性下降；铁含量减少；Western blot显示ACSL4降低，GPX4和SLC7A11升高。

**3.6 KLF4转录激活SMAD7**
hTFtarget数据库预测SMAD7为KLF4靶基因，JASPAR预测SMAD7启动子含有KLF4结合基序（5'-CACCCC-3'）。ChIP-qPCR显示抗KLF4抗体富集SMAD7启动子；双荧光素酶报告基因实验显示KLF4敲低降低野生型SMAD7启动子活性，对突变型无影响；过表达KLF4增加野生型活性。体内外实验均证实KLF4敲低降低SMAD7 mRNA和蛋白水平。

**3.7 KLF4可能至少部分通过SMAD7促进七氟烷诱导的神经元损伤**
在七氟烷处理的HT22细胞中，SMAD7敲低提高细胞活力、降低凋亡率和caspase-3活性，而KLF4过表达逆转这些保护作用；对氧化应激和铁死亡标志物（ROS、铁、MDA、LDH、GSH、T-AOC、SOD、CAT、GPX、ACSL4、GPX4、SLC7A11）的分析显示，SMAD7敲低改善各项指标，KLF4过表达部分恢复SMAD7表达并逆转保护效应。

**3.8 麻醉和手术后海马中铁死亡相关标志物的细胞类型特异性分布**
多重免疫荧光显示，GPX4减少主要发生在NeuN阳性神经元，而Iba1阳性小胶质细胞中GPX4无明显变化；ACSL4上调在神经元和小胶质细胞中均可见；4-HNE积累在两种细胞类型中均增加。

**3.9 KLF4敲低通过调节TFR1、FTH1和FPN1表达恢复铁稳态**
手术组海马TFR1升高，FTH1和FPN1降低；KLF4敲低逆转这些变化。体外HT22细胞中结果一致。

**3.10 凋亡和铁死亡在KLF4相关神经元损伤中的药理学分离**
KLF4过表达并暴露于七氟烷的HT22细胞中，Z-VAD-FMK部分恢复细胞活力，但没有影响脂质过氧化（C11-BODIPY比值）；Fer-1显著降低脂质过氧化，恢复GPX4和SLC7A11表达，并提供更强的细胞保护。表明凋亡和铁死亡平行激活，铁死亡主要驱动脂质过氧化。

**3.11 SMAD7敲低部分挽救KLF4过表达诱导的毒性（无七氟烷暴露）**
单独KLF4过表达降低细胞活力、增加caspase-3活性和脂质过氧化，共转染shSMAD7部分逆转这些效应，提示SMAD7是KLF4毒性的重要但非唯一介质。

讨论部分总结：本研究首次证明KLF4/SMAD7轴在海马神经元中与PND相关的氧化应激、铁死亡标志物改变和凋亡相关联。KLF4通过直接结合SMAD7启动子（5'-CACCCC-3'）激活其转录。KLF4敲低通过多节点调控（包括恢复GPX4/SLC7A11、抑制TFR1介导的铁摄取、增加FTH1/FPN1介导的铁储存和输出）实现广泛保护。药理学实验表明凋亡和铁死亡平行存在，铁死亡贡献脂质过氧化，凋亡贡献细胞死亡。SMAD7敲低部分缓解KLF4诱导的毒性，但非完全。研究存在局限性：缺乏仅麻醉和假手术对照组，仅使用雄性小鼠，铁死亡证据主要基于标志物，SMAD7下游机制未明确（如TGF-β/Smad2/3信号）。结论：麻醉和手术后海马神经元KLF4上调，与认知功能障碍、氧化应激、铁死亡及凋亡标志物改变相关。KLF4直接结合SMAD7启动子并增加其表达，与GPX4/SLC7A11抑制及铁稳态失调（TFR1升高，FTH1/FPN1降低）相关。KLF4/SMAD7信号通过平行通路与神经元损伤相关，铁死亡主要贡献脂质过氧化，SMAD7主要贡献凋亡和细胞活力。该发现为假设生成性，需进一步验证。