妊娠期或哺乳期接触FireMaster 550会改变草原田鼠杏仁核中与突触功能相关的基因表达

《NeuroToxicology》：FireMaster 550 Differentially Alters Gene Expression Underlying Synaptic Function in Amygdala of Prairie Voles After Gestational or Lactational Exposure

　　•这项研究表明，在神经发育过程中接触Firemaster 550所带来的影响取决于暴露的时间、个体的性别以及这些因素之间的相互作用。在妊娠期或哺乳期母体接触该物质会不同地改变草原田鼠杏仁核中的基因表达，而杏仁核是这类动物社会情感处理的核心区域。不同的暴露时间/性别组合会影响到一些重叠的也有独特的生物过程，包括突触传递、谷氨酸信号传导、轴突导向以及线粒体自噬等。这些发现强调了在考虑神经发育毒性影响及风险时，神经发育背景（即暴露发生的时间）以及性别的重要性。

引言
尽管人们对这一话题很感兴趣，但关于环境因素如何导致神经发育障碍发病率上升的相关信息却十分匮乏。此外，为了解清这一问题所需的基本实验工具，比如关于关键暴露窗口的知识、用于检测神经发育毒性的有效筛选平台，以及与人类相关的神经发育障碍模型，都还不够完善。为此，我们采用了转录组学方法，结合两个不同的暴露窗口、两种数据分析技术、一种极为适合的动物模型，以及“研究领域标准”心理健康框架作为实验设计的核心，以此填补现有知识空白。本研究发现的路径和基因有助于确定生物标志物和关键指标，这些对于开发针对神经发育障碍的新方法以及更有效地识别体内和环境中的潜在神经发育毒性物质具有非常重要意义。

神经发育障碍是一类在发育过程中出现的心理行为和认知障碍，它们会持续且显著地影响患者的运动技能、认知能力、学习能力以及社交功能（Thapar & Cooper, 2016）。虽然各类神经发育障碍在诊断和临床表现上各有不同，但许多疾病在认知和社会情感功能等跨诊断维度上存在相似的缺陷。鉴于心理健康问题与神经发育障碍存在共同的病理机制，美国国家精神卫生研究所制定了“研究领域标准”框架，将人类行为划分为六个典型的神经行为功能领域，每个领域都包含可从正常到异常的全范围功能结构，便于研究人员进行研究。这一框架使得研究者能够研究“亲密关系与依恋”等特征及其背后的神经内分泌系统，而无需单独研究某一种特定的神经发育障碍。同时，它还为研究化学物质暴露如何影响不同神经发育障碍之间共有的遗传、神经生理和电路层面的生物学特征提供了方向，是了解环境因素如何增加神经发育障碍风险的强大工具。

神经发育障碍具有高度的遗传性（Colvert et al., 2015, Faraone and Larsson, 2019, Gaugler et al., 2014, Grimm et al., 2020），但仅靠遗传因素无法完全解释神经发育障碍的整体风险，其病因是由多基因变异与环境因素的共同作用决定的（Keil-Stietz and Lein, 2023, Palladino et al., 2019, Sullivan and Geschwind, 2019, Thapar and Cooper, 2016）。在动物模型中，研究表明，接触常见的环境污染物，如商业阻燃剂混合物FireMaster? 550中的各种成分，会影响神经发育障碍患者所表现出的社会情感功能缺陷，包括啮齿类动物和斑马鱼的社会情感行为及焦虑症状（Bailey and Levin, 2015, Gillera et al., 2020, Glazer et al., 2018, Wiersielis et al., 2020, Witchey et al., 2020）。不过，FM 550各成分的毒代动力学在不同发育阶段存在显著差异（GE或LE阶段；Phillips et al., 2016），而且暴露时间与表型结果之间的关系目前仍不十分清楚。

值得注意的是，在FM 550的各组成成分中，有机磷酯类物质的代谢速度更快，且在哺乳期的传递效率也低于溴化物成分（Phillips et al., 2016）。此外，FM 550在特定发育阶段对关键神经发育过程的影响机制至今尚未明确。这一点对人类健康尤为重要，因为人类的神经发育贯穿产前和产后时期，大脑成熟的诸多过程，如突触重塑、神经元分支形成、胶质细胞生成以及髓鞘形成，会在出生后数年仍然持续进行（Barkovich, 2005, Rice and Stan., 2000, van Dyck and Morrow, 2017），远在大部分神经元生成、凋亡和迁移完成之后。这意味着，在成年前的任何特定时间点，都有一部分神经发育机制处于活跃状态，并可能受到外界因素的影响。因此，在不同时间点的外源性干扰很可能对大脑的发育进程以及后续的神经发育障碍风险产生不同的影响。对于神经发育而言，暴露发生的时间与剂量一样重要。

需要指出的是，人类在不同关键发育阶段的FM 550暴露程度差异很大，包括孕妇（Castorina et al., 2017, Doherty et al., 2019）、儿童（Hoffman et al., 2024）以及婴儿（Hammel et al., 2020）。有研究显示，幼儿体内的该物质负荷是其母亲的6到15倍（Butt et al., 2014），这凸显了不同年龄组和发育阶段之间的暴露差异。幼儿及其他脆弱群体面临的高暴露现象较为普遍，尤其是在出生后的早期阶段，这引发了严重的神经发育毒性担忧。

儿童时期接触含FM 550在内的阻燃剂，与多种认知缺陷有关，表现为沟通能力发展、早期学习能力、执行功能方面的表现较差（Doherty et al., 2019, Hall et al., 2023），智力水平下降，工作记忆能力减弱（Castorina et al., 2017）。此外，FM 550的各成分与社交行为缺陷也存在剂量依赖关系，具体表现为责任感降低、外向行为问题增多以及自信度下降（Lipscomb et al., 2017）。社交互动/沟通障碍是自闭症谱系障碍的两个核心临床诊断特征之一，也是包括自闭症谱系障碍、精神分裂症、焦虑症以及情感障碍在内的多种神经发育和精神疾病所共有的跨诊断特征。人类神经影像学研究指出，杏仁核是社会情感网络的重要调控中心（Adolphs, 2009），而“研究领域标准”则将其列为“急性威胁‘恐惧’”以及“亲密关系与依恋”两大概念下的重点研究区域（美国国家精神卫生研究所，RDoC矩阵）。自闭症患者往往表现出杏仁核体积增大或连接性降低，其社交功能受损的程度与杏仁核的结构变化或连接异常程度高度相关（Gotts et al., 2012, Kim et al., 2010, Lee et al., 2022, Rausch et al., 2016, Schumann et al., 2009）。相反，杏仁核的过度活跃和反应过度则与包括社交恐惧症在内的焦虑障碍有关（?imi? et al., 2021）。因此，了解FM 550及其他污染物如何影响社会情感相关脑回路及其核团，尤其是杏仁核的发育，对人类健康具有极其重要的意义。

在这项研究中，我们选择了草原田鼠作为实验模型，因为它是一种非常适合用于研究社会行为和认知功能的啮齿类动物，具有很强的亲社会倾向，能够自发形成稳定的伴侣关系，实行社会一夫一妻制，由双亲共同照料，并表现出强烈的亲社会行为（McGraw & Young, 2010）。与人类类似，草原田鼠的杏仁核连接性和功能对其社交行为至关重要，尤其是在伴侣关系的建立与维持方面（Lopez-Gutierrez et al., 2021）。通过这一动物模型，我们已经三次证明，母体在发育期间接触FM 550会导致其后代出现性别差异化的社会情感障碍：雄性个体会失去对伴侣的偏好，而雌性个体虽然仍保持正常的伴侣偏好，但整体社交性降低，且焦虑行为加剧（Gillera et al., 2020, Gillera et al., 2022, Krentzel et al., 2021）。社会一夫一妻制和伴侣依恋是人类与草原田鼠社交行为的核心特征，但实验室里的老鼠则不会自发表现出这些行为。正因如此，草原田鼠才是研究这一课题的最佳动物模型。

为了更深入地了解FM 550暴露对神经发育和社会情感行为相关关键时期的影响，我们让草原田鼠的后代在妊娠期（GD1-GD21）或哺乳期（P1-P21）期间，通过母体口服方式接触FM 550，持续21天。随后，我们采用两种不同的转录组学方法来分析基因表达情况。在实验1中，我们对成年田鼠杏仁核的完整转录组进行了RNA测序，然后运用两种相互独立但数学上互不相关的分析方法来处理数据：一种是利用线性统计方法识别差异表达基因，另一种则是运用监督式集成机器学习方法，识别能够预测暴露影响的基因。在实验2中，我们则利用NanoString平台，针对在前一个RNA测序实验中发现的候选基因，对另一组受暴露影响的田鼠的25种RNA转录本进行靶向分析。

通过这种综合分析方法，我们旨在在先前研究的基础上进一步探索FM 550在产前和产后发育阶段暴露如何导致雄性个体丧失伴侣绑定能力以及雌性个体出现焦虑行为，并试图确定这些社会情感变化的潜在分子机制，同时阐明暴露在神经发育的两个关键时期对基因表达的不同影响。

材料与方法
在撰写本手稿时，我们遵循了“动物研究：体内实验报告”指南中的“基本10项”检查清单，所有要求均已满足。该指南是在美国国家替代、优化和减少动物实验中心推动的“3R”计划框架下制定的，旨在提升动物实验研究的报告质量。本实验所使用的所有组织样本均来自已存档的样本库。

实验1：利用线性统计方法分析杏仁核RNA测序数据
在妊娠期的雄性田鼠中，经过多重比较校正（q ≤ 0.05）后，共识别出642个显著的差异表达基因，其基因表达倍数变化范围在±1.20之间（图2）。同样，在妊娠期的雌性田鼠中发现了346个差异表达基因，而在哺乳期的雄性田鼠中则有555个，哺乳期的雌性田鼠则有827个差异表达基因（图2）。对妊娠期差异表达基因的基因本体论分析显示，无论在雄性还是雌性田鼠中，与细胞通讯、发育和信号传导相关的通路都显著富集（图3）。具体而言，在“基因本体论·生物过程”分类中，排名靠前的通路包括……

讨论
在本研究中，我们发现了在发育过程中接触FM 550后，成年草原田鼠杏仁核中的基因表达和生物通路发生了变化，而这些变化取决于暴露的具体时期（妊娠期 vs 哺乳期）、性别以及两者之间的相互作用。在实验1中，所有组的基因表达都出现了与突触相关的变化，其中大量基因与谷氨酸能传递和突触可塑性有关。特别是在妊娠期出生的后代中，……

结论
在草原田鼠中，发育过程中接触FM 550会导致其年轻成年期的杏仁核基因表达发生改变，而杏仁核正是社会情感脑功能的核心区域。这些表达变化与暴露时间密切相关，无论性别如何，突触都是受影响的关键靶点。为提升研究的实际应用价值，我们选用了一种非常适合用于研究依恋行为及其他亲社会特性的动物模型，并将其与“研究领域标准”框架相结合，后者是一个与人类情况密切相关的分析框架，有助于我们更好地理解……

未引用参考文献
(Baker et al., 2017, Pico et al., 2009, Halls et al., 2015, Jutla et al., 2022, Kupferberg et al., 2016, Lai et al., 2014, Lam et al., 2022, National Institute of Mental Health, n.d, Ribic and Biederer, 2019, Ros and Graziano, 2018)

资金支持
美国国家环境卫生科学研究所ZIA-ES103404项目；以及U01 ES-035843项目。本研究部分得到了美国国立卫生研究院内部研究计划——美国国家环境卫生科学研究所的资助。参与该研究的NIH作者所完成的工作属于美国政府的工作成果。本文中所呈现的研究结果和结论仅为作者个人观点，并不一定代表NIH或美国卫生与公众服务部的立场。

CRediT作者贡献说明
刘丽文：正式分析。凯文·格里什：监督、方法设计。维贾亚拉克希米·潘杜里：数据整理。帕蒂索尔·希瑟·B：写作——审阅与编辑、项目管理、资金申请、概念设计。吉勒拉·萨吉·E：资源提供、概念设计。伯杰·詹娜·M：写作——审阅与编辑、研究调查。纽厄尔·安德鲁·J：写作——审阅与编辑、初稿撰写、验证、方法设计、研究调查、正式分析、数据整理、概念设计。Massri Abdull利益冲突声明：作者声明自己不存在任何可能影响本文所汇报工作的已知财务利益或个人关系。

致谢：作者衷心感谢Heather Stapleton及其实验室为制备给药溶液所做的工作，同时也感谢北卡罗来纳州立大学生物研究设施的动物护理人员为动物照料和饲养所付出的努力。

Andrew J. Newell | Abdull J. Massri | Sagi E. Gillera | Jenna M. Berger | Vijayalakshmi Panduri | Liwen Liu | Kevin Gerrish | Heather B. Patisaul