探讨从针插甲虫中获取的历史DNA质量

《Ecology and Evolution》：Exploring the Quality of Historic DNA From Pinned Beetles

　　

为生物多样性研究获取新鲜DNA样本通常具有挑战性。自然历史标本馆提供了一种替代数据获取途径，尽管历史收藏中的干制标本DNA通常已降解并可能受到污染。本研究测试了三种标准DNA分离方法，使用20个相同的乙醇保存和干制甲虫标本以获得用于基因组测序的DNA。将表现最佳的方法应用于一组更大的新鲜与历史标本，这些标本代表Trichodes属的74个物种和Cleridae科（Coleoptera）其他属的33个物种，以评估标本年龄和分离DNA量对DNA序列质量指标的影响。与大多数先前研究不同，研究人员通过片段长度分析和全基因组测序（whole-genome sequencing）来评估分离DNA的质量。本研究使用的基于硅胶柱的寡核苷酸分离方案（oligo isolation protocol）在短DNA片段回收方面优于标准硅胶柱和沉淀法分离方案。干制标本中分离DNA的片段长度随样本年龄略有下降，而DNA分离量保持不变。较高的DNA量导致显著更多的恢复位点（recovered loci）和更长的多序列比对，且空隙更少。干制样本中的污染水平显著更高。研究结果表明，常用DNA分离试剂盒适用于干制博物馆标本的第二代测序（next generation sequencing, NGS），无需专用洁净室设施或危险试剂。与样本年龄相比，分离DNA的绝对量对序列质量影响更大，即使从较老的干制标本中也能恢复大量基因组序列信息。研究结果强调了历史昆虫标本作为分子数据来源的潜力，且DNA分离方案易于应用。

**研究背景与问题**
DNA数据在现代生物多样性研究中不可或缺，例如群体遗传学、系统分类学和分子系统发育学。然而，野外采集新鲜标本常受限于物种稀有性、时间、法规、经费或安全等因素。自然历史收藏馆藏全球超过11亿份样本，为获取历史DNA（historic DNA, hDNA）提供了替代途径。但干制博物馆标本的DNA通常高度降解，平均片段长度不足100碱基对（base pairs, bp），且易受微生物污染。先前研究对样本年龄与DNA产量、片段长度及序列质量之间的关系存在不一致结论，且污染水平的影响尚未充分量化。因此，研究人员开展本研究，旨在系统评估干制甲虫标本中样本年龄和DNA分离量对基因组序列质量（如空隙度、恢复位点数、恢复碱基数）的影响，并比较不同DNA分离方法的效率。
**研究内容与结论**
研究人员测试了三种商业DNA分离试剂盒（标准硅胶柱、寡核苷酸硅胶柱、沉淀法）在20个相同干制与乙醇保存甲虫标本上的表现，发现寡核苷酸硅胶柱（oligo silica-column）法显著提高了DNA产量（中位数89.9 ng，均值303.0 ng），为标准硅胶柱法的4.26倍和沉淀法的6.82倍。将该最佳方法应用于111个标本（82干制、49乙醇保存，代表Trichodes属74种和Cleridae科其他33属），年龄范围2–118年。通过全基因组测序（whole-genome sequencing）和基于2897个直系同源组（orthologous groups, OGs）的参考引导组装，评估了DNA量、样本年龄对序列质量（空隙度、恢复碱基数、恢复位点百分比、目标DNA比例）的影响。结果表明，DNA量对序列质量有显著正向影响：DNA量增加显著降低空隙度、增加恢复位点数和碱基数，并在干制标本中边际显著提高目标DNA比例（p=0.053）。样本年龄对干制标本的DNA量无显著影响，但片段长度每年下降约0.51%（平均78 bp）。年龄对空隙度和恢复位点数的影响不显著，但趋势表明老化可能降低质量。乙醇保存标本整体表现优于干制标本。污染分析显示，干制标本中非昆虫DNA比例显著更高（范围37.39%–99.26%），主要来自其他真核生物、植物和细菌，且与样本年龄无显著相关，但DNA量低时PCR重复率升高。
**关键技术方法**
样本来源包括Roland Gerstmeier收藏（CRG，德国慕尼黑）和萨尔茨堡大学环境与生物多样性系。主要方法包括：三种DNA分离比较（裂解后均分样本，使用Qubit荧光计和Agilent Fragment Analyzer测量DNA浓度和片段长度）；全基因组测序（Illumina NovaSeq X Plus，覆盖度约24×）；基于九种郭公虫科（Cleridae）物种的mRNA测序和参考基因组（Tillus elongatus）构建OGs；使用CAPTUS-pipeline进行参考引导序列提取和比对；污染估计通过Centrifuge数据库匹配reads得到。
**研究结果**
- **3.1 DNA分离比较**：寡核苷酸硅胶柱法在干制和乙醇保存样本中均获得最高DNA产量（Kruskal-Wallis检验，H=14.95，p<0.001），与其他方法差异显著（p<0.05和p<0.01），标准硅胶柱与沉淀法间无显著差异（p=0.19）。
- **3.2 DNA量对序列质量的影响**：DNA量增加显著降低干制标本的空隙度（adj. R²=0.069，p<0.05），增加恢复碱基数（adj. R²=0.064，p<0.05）和恢复位点百分比（adj. R²=0.087，p<0.01）。乙醇保存标本中DNA量对空隙度（adj. R²=0.205，p<0.01）、恢复碱基数（adj. R²=0.125，p<0.05）和恢复位点百分比（adj. R²=0.123，p<0.05）的影响均显著，且对目标DNA比例有强显著影响（adj. R²=0.726，p<0.001）。
- **3.3 样本年龄对序列质量的影响**：干制标本中样本年龄对DNA量无显著影响（p=0.52），但对片段长度有显著负效应（adj. R²=0.261，p<0.001），每年下降0.51%。年龄对空隙度、恢复碱基数、恢复位点百分比和目标DNA比例的影响均不显著（p>0.05）。乙醇保存标本中，年龄未显著影响任何指标，但目标DNA比例边际显著（p=0.05）。
- **3.4 污染估计**：干制标本中污染read比例变幅较大（37.39%–99.26%），主要来自其他真核生物、植物和细菌（如Enterobacter cloacae）。乙醇保存标本中目标DNA比例显著更高（Wilcoxon检验，W=52，p<0.001）。DNA量低时PCR重复率高，导致文库复杂度降低。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，寡核苷酸硅胶柱法适用于干制昆虫标本，可最大化回收短DNA片段，且DNA量比样本年龄对序列质量影响更大。干制标本中片段长度随年龄下降但速率缓慢，而污染水平显著高于乙醇保存标本，源于保存历史差异。研究建议使用短DNA片段（<70 bp）的分离方案，以提高NGS中的位点回收率。结论部分强调：常用DNA分离试剂盒可有效应用于干制博物馆标本的NGS，无需专用洁净室或危险试剂；高初始DNA量是获得高质量序列数据的关键；历史昆虫标本具有作为分子数据来源的巨大潜力，易于应用的方法可促进生物多样性研究和保护。论文发表在《Ecology and Evolution》。