《Environmental DNA》：Evaluating 18S Phylogenetic Placement Accuracy to Uncover Hidden Diversity in Non-Bilaterian Animals
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小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）——真核生物中的18S——是一个普遍存在的基因，在早期分子系统发育中对于解决古老亲缘关系至关重要。如今，尽管多位点系统基因组学占主导地位，SSU rRNA序列仍作为生物多样性的分子标识符。系统发育定位利用参考系统发育树和给
小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）——真核生物中的18S——是一个普遍存在的基因，在早期分子系统发育中对于解决古老亲缘关系至关重要。如今，尽管多位点系统基因组学占主导地位，SSU rRNA序列仍作为生物多样性的分子标识符。系统发育定位利用参考系统发育树和给定的进化模型对环境DNA进行分类注释，使得能够更准确地识别可能属于未知谱系的差异序列。在本研究中，研究人员首先通过整理PR2数据库中的序列，构建了最大的非两侧对称后生动物18S序列数据集。然后，将其作为案例研究，在系统发育定位框架内测试了常见18S条形码（V4、V9和全长18S）的性能。研究人员发现，V9区域通常缺乏足够的系统发育信号以实现可靠的定位。当环境多样性在参考树中有所代表时，V4区域是准确的，但在处理分歧谱系时存在困难。全长18S克服了短读长的局限性，成为揭示主要进化支的最稳健选择。最后，研究人员将系统发育定位应用于实际的环境18S数据。研究人员观察到非两侧对称动物群落的区域差异，并基于长序列条形码恢复了一个推测为栉水母动物门（Ctenophora）姊妹群的支系。
**论文解读：基于18S系统发育定位的非两侧对称动物隐藏多样性评估**
**研究背景与问题**
小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）基因（真核生物中为18S rRNA）是生物体中普遍存在的标志基因，曾用于解决早期分子系统发育中的古老亲缘关系，例如发现古菌域（Archaea）并推动动物系统学的建立。然而，随着多位点系统基因组学的发展，单基因分析的传统角色被取代。尽管如此，18S序列因其通用引物、多拷贝特征及在环境DNA（eDNA）中的高丰度，仍是生物多样性鉴定的关键分子标识符。当前eDNA代谢条形码研究中，短读长技术（如V4、V9高变区）广泛应用，但面临分类注释准确性不足、高度分歧序列被丢弃等问题。传统基于相似性阈值的方法难以校准，而系统发育定位（Phylogenetic Placement）通过进化模型将查询序列映射到参考系统发育树，可实现对未知或未表征谱系的识别。然而，不同18S条形码（V4、V9、全长）在系统发育定位中的表现尚未系统评估，尤其是在非两侧对称动物（non-Bilateria）这一关键类群中。非两侧对称动物包括海绵动物门（Porifera）、刺胞动物门（Cnidaria）、栉水母动物门（Ctenophora）和扁盘动物门（Placozoa），其基部位置对理解动物起源至关重要，但现有参考树存在注释错误和多样性不足的问题。为此，研究人员开展了本研究，旨在通过构建高质量参考数据集，评估不同18S条形码在系统发育定位中的准确性，并揭示非两侧对称动物的隐藏多样性。
**研究内容与结论**
研究人员首先从PR2数据库（Protist Ribosomal Reference，版本5.0.0）中整理出5568条非两侧对称动物18S序列，通过EukRef社区流程进行质量控制，剔除116条错误注释序列（占3.1%），并补充32个两侧对称动物（Bilateria）和20个非动物外群类群，最终构建了包含4408个末端节点的完整参考主干树（complete BT）。此外，针对V4和V9区域，分别构建了仅含相应序列的参考树（V4 BT含3166个末端，V9 BT含883个末端），以及同时包含V4和V9的共有参考树（common BT含710个末端）。系统发育推断采用最大似然法（ML，IQ-TREE v2.1.2，GTR+G4+I模型）和贝叶斯法（Phylobayes-MPI，CAT+GTR+G模型），并强制海绵动物门在共有参考树中为单系群（基于贝叶斯树和系统基因组学共识）。
通过敏感性分析，研究人员测试了三种条形码在多样性已知（随机移除20%、50%、80%序列）和多样性未知（移除整个类群/门）场景下的定位准确性，并以正确放置百分比（PCP）和似然权重比（LWR）为指标。结果表明：V9区域在多数情况下表现最差，即使在多样性已知时也出现高比例错误放置（如Homoscleromorpha海绵100%错误），且在模拟未知类群时几乎无法识别；V4区域在多样性已知时表现良好（PCP>75%），但处理分歧谱系时仍存在误差；全长18S在所有场景中表现最优，在未知类群场景下严格正确放置率可达32%~99%，且EDPL（放置位置期望距离）显著更低。进一步分析揭示，V9的高序列变异性（组成异质性和熵饱和程度最高）是导致其错误吸引外群序列至内群分歧支系的主要原因。在模拟生物数据集（mock dataset）中，V9高估非两侧对称动物比例（49.97% vs 实际1.39%），而V4和全长18S更准确，其中V4在丰富参考树中表现甚至优于全长18S。
**关键技术与方法**
主要技术方法包括：（1）参考序列质量控制：基于EukRef流程，利用ssu-align v0.1.1考虑SSU rRNA二级结构进行比对，ClipKIT动态阈值修剪，ML和贝叶斯法构建系统发育树并迭代剔除错误注释序列；（2）系统发育定位分析：采用Papara v2.5将查询序列比对至参考比对，EPA-ng v0.3.4（过滤LWR≥0.99）将序列映射至参考树，Gappa v0.4.0进行分类注释并计算EDPL；（3）敏感性分析：通过随机剪枝或移除整个类群模拟已知/未知多样性，计算PCP和LWR阈值（0.5、0.7、0.9）；（4）经验数据应用：来自Tara Oceans环航项目（5个站位，表层和深层叶绿素最大层）的V4和V9代谢条形码数据，以及Jamy等（2022）的长读长18S扩增子数据集（包含深海样本）。样本来源包括全球多个海洋区域，如意大利南部、马达加斯加、南极、智利北部、亚速尔群岛。
**研究结果**
**3.1 主干树生成**
经过质量控制，最终完整主干树包含4408个末端节点（非两侧对称动物），V4 BT含3166个末端，V9 BT含883个末端，共有主干树含710个末端。ML树中海绵动物门为非单系群（Silicea为其余动物姊妹群），但贝叶斯分析恢复其单系性，并强制应用于共有主干树。
**3.2 18S系统发育定位的敏感性分析评估**
**3.2.1 多样性在主干树中代表的定位准确性**
使用共有主干树时，大多数已知类群的PCP超过75%。V9性能最差，尤其在Homoscleromorpha中100%错误，并错误将外群序列置于刺胞动物门和海绵动物门；V4表现优于V9，但错误将外群序列置于海绵动物门；全长18S与V4总体相似，但在处理高度分歧的两侧对称动物和非动物序列时略优。使用丰富参考树时，所有条形码的PCP均提高。
**3.2.2 多样性不在主干树中代表的定位准确性**
模拟未知类群场景下，V9严格正确放置率极低（最高5.82%），V4有所改善但有限，全长18S表现最佳（严格正确放置率32%~99%），其中刺胞动物门和Medusozoa缺失场景下几乎完美。放松正确放置标准后，全长18S在多数场景下成功率达99%以上。分析表明，V4和V9的贡献仅占正确放置的极小比例（<4%），未知类群识别主要依赖全长18S。
**3.2.3 模拟生物数据集上的类群丰富度评估**
V9几乎完全无法正确反映真实多样性，高估非两侧对称动物比例（49.97% vs 实际1.39%），错误序列主要聚集于Demospongiae和Hydrozoa枝；V4在丰富参考树中表现良好（推断2.62% vs 实际2%），甚至优于全长18S；全长18S表现中等。进一步分析显示，V9的高序列变异性（RCFV=0.0413，λ=0.185）是其错误吸引的原因，且与V4相比，V9在多数类群内和类群间遗传距离更大。
**3.3 应用于实际代谢条形码数据**
Tara Oceans五个站位的V4和V9数据表明，V9的非两侧对称动物OTU比例常比V4高一个数量级，且V9的类群丰富度在各地一致（与模拟结果相符）。V4数据显示，非两侧对称动物占OTU的0.4%~2.5%，多样性主要由地理位置驱动而非深度；刺胞动物门（尤其是Hydrozoa）最丰富，但南极和亚速尔样本中海绵动物门与刺胞动物门相当。长读长数据中，5个OTU被自信地定位为所有已知栉水母动物门的姊妹群，全部来自深海层（1200米，Malaspina环航第49站）。BLAST对比和额外ML树（18S和28S）支持其中4个OTU可能为栉水母近缘，但28S树显示其嵌套于冠群栉水母内，提示核糖体基因间的进化不一致性。
**讨论与结论**
研究构建了首个高质量非两侧对称动物18S参考数据集，并系统评估了不同条形码在系统发育定位中的性能。V9区域因序列变异性过高，在未知谱系识别中可靠性极低，建议谨慎使用；V4区域在多样性已知时表现良好，但处理未知类群时仍存在局限；全长18S是揭示隐藏多样性的最稳健选择，但即使使用全长序列，部分未知类群仍无法准确放置，提示隐藏多样性可能被低估。研究还发现，参考树的外群采样丰富度对定位准确性至关重要。在经验数据中，研究揭示了非两侧对称动物群落的全球分布模式，并基于长读长数据发现了一个可能为深海栉水母的未知进化支，为早期动物演化研究提供了新线索。
**结论翻译**：在基因组学时代崛起的背景下，研究人员将注意力重新转向一个对当前理解生命之树至关重要的基因。研究人员为SSU rRNA遗传资源的整理做出贡献，并通过系统发育定位测试其在发现动物多样性中的价值。研究人员为非两侧对称动物提供了四个参考物种树。基于动物序列分析的结果，研究人员建议在代谢条形码项目中，当鉴定参考树中包含的纲或门时，应使用更可靠的V4区域而非V9区域，但两者在处理未知类群时均存在问题。这些局限性可通过使用全长18S条形码部分解决。当应用系统发育定位分析来自全球五个不同海洋地点的实际代谢条形码数据时，研究人员观察到非两侧对称动物群落的区域差异，其中刺胞动物门或海绵动物门交替主导。令人兴奋的是，基于全长18S代谢条形码数据，研究人员发现了可能是深海栉水母的未知（或未表征）分歧支系的证据。通过阐明18S扩增子在系统发育定位中的潜力和局限性，本研究为利用环境测序揭示生命之树中的隐藏多样性提供了一个改进的框架。
