《Ecology and Evolution》：A Comparison between Passive airDNA Collection and Extraction Methods on the Recovered Terrestrial Vertebrate Assemblage
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在过去五年中，空气环境DNA（airDNA）的收集已成为一种用于陆生脊椎动物生物监测的新型工具。与其他环境DNA（eDNA）收集基质（如土壤和水）类似，空气DNA的过滤虽然前景广阔，但在广泛应用前需要进行严格的方法学测试。影响恢复物种群落的两个eDNA过滤方面
在过去五年中，空气环境DNA（airDNA）的收集已成为一种用于陆生脊椎动物生物监测的新型工具。与其他环境DNA（eDNA）收集基质（如土壤和水）类似，空气DNA的过滤虽然前景广阔，但在广泛应用前需要进行严格的方法学测试。影响恢复物种群落的两个eDNA过滤方面是收集和提取方法。在此，研究人员评估了三种收集基质：布质滤膜、石蜡纱布和PCR板封口膜，以及四种易于获得的提取试剂盒：Qiagen DNeasy Blood & Tissue、Qiagen DNeasy PowerSoil Pro、MagMAX Total Nucleic Acid Isolation和Quick-DNA Miniprep Plus提取试剂盒的性能比较。研究人员在澳大利亚昆士兰东南部Tarradarrapin Creek Wetlands内的一个河岸城市公园中部署了这些被动空气DNA滤膜。通过使用通用哺乳动物引物和通用脊椎动物引物，研究人员证明，布质滤膜与Blood & Tissue提取试剂盒的组合记录了最高数量的总体和信息性陆生脊椎动物操作分类单元（OTU），以及重复样本之间多样且非变异的物种群落。在此，研究人员表明，优化空气DNA方法，特别是使用布质滤膜与Blood & Tissue提取试剂盒，能够提高这种新型生物监测技术的性能，这是支持其与传统监测方法（如相机陷阱、生物声学或水生环境DNA）并用的关键一步。
**论文解读：被动空气DNA收集与提取方法对陆生脊椎动物群落恢复的比较研究**
**研究背景与问题**
准确的生物多样性评估是改善保护规划的关键。传统监测方法（如相机陷阱、活体捕捉、生物声学阵列和检测犬）虽已广泛应用，但受限于成本、人力或覆盖范围。近年来，空气环境DNA（airDNA）作为一种新兴的陆生脊椎动物监测工具显示出潜力，但其方法学尚未经过严格测试与优化。类似于水生环境DNA（eDNA）技术的发展，空气DNA的验证需要优化三个关键环节：DNA提取方法（影响产量和质量）、DNA收集方法（环境中的有效性）以及引物选择（准确区分目标物种）。然而，目前仅有少数研究比较了植物空气DNA的提取、引物和收集方法，且发现提取试剂盒和引物影响最大，而收集方法本身表现相似。此外，被动空气DNA收集方法（如石蜡涂层玻片、灰尘陷阱、叶片擦拭、微纤维滚轮、无菌布和法医胶带）的介质性能差异尚未被系统评估。因此，本研究旨在针对动物群落，评估三种被动空气DNA收集方法（布质滤膜、石蜡纱布和PCR板封口膜）与四种常用DNA提取试剂盒的组合效果，并使用通用哺乳动物和脊椎动物引物，以确定有效且可靠的方法，用于收集、提取空气DNA并增加物种检测广度。
**主要技术方法**
本研究在澳大利亚昆士兰东南部Redland Bay流域的Tarradarrapin Creek Wetlands（28×9 m区域，13棵树）进行。研究人员于2024年6月10日部署144个滤膜（每种滤膜类型48个），于6月12日收集，立即冷冻至-20°C。三种被动滤膜类型为：布质滤膜（Leukoplast无菌棉纱布，7.5×7.5 cm）、石蜡纱布（Cuticell Classic Paraffin Gauze Dressing，5×5 cm）和PCR板封口膜（6×3 cm，共4份）。使用四种提取试剂盒：Qiagen DNeasy Blood & Tissue（BT）、Qiagen DNeasy PowerSoil Pro（PS）、MagMAX Total Nucleic Acid Isolation（MM）和Quick-DNA Miniprep Plus（Zymo，ZY）。通过二代测序（NGS）使用Mamm02引物（靶向12S线粒体基因74 bp区域，含人阻断引物）和V12S-U引物（靶向208 bp区域）进行宏条形码分析。仅对布质和石蜡样本测序（PCR板封口膜因非特异性扩增被排除）。生物信息学流程包括usearch合并、cutadapt修剪、BBMap聚类（95%相似度）为OTU，并通过MegaBLAST比对本地数据库（含1431种澳大利亚物种的12S/16S序列）进行物种注释。
**研究结果**
**3.1 物种丰富度**
使用两种引物共获得51个独特OTU，其中36个可鉴定至物种水平。结合引物数据集，布质滤膜与BT提取试剂盒组合（C|BT）在所有OTU子集（总OTU、命名OTU、信息性OTU）中记录到显著更高的物种丰富度（p<0.001），而家庭OTU子集中C|BT与C|ZY和P|ZY表现相似。石蜡滤膜独立于提取试剂盒，其OTU检测数量显著低于布质滤膜（p<0.001）。DNA浓度对OTU丰富度无显著预测作用（p=0.191）。
**3.2 群落组成**
非度量多维尺度分析（NMDS）显示，C|BT组合在总OTU、命名OTU和家庭OTU中记录到独特的群落组成，与其他组合显著不同（p<0.001）。信息性OTU的群落组成在组合间无显著差异（p>0.05），表明其分布具有随机性。β离散度分析显示，除总OTU中C|MM组合因近零检测导致离散度异常外，其余组合内重复样本间变异无显著差异，表明群落组成差异为真实生物学信号。
**3.3 β多样性**
总OTU和命名OTU的β多样性主要由物种周转（turnover）驱动（分别占75.2%和72.3%），而家庭OTU的β多样性完全由嵌套性（nestedness）驱动（100%），即所有组合检测到的家庭物种均为C|BT检测到的子集。信息性OTU的β多样性以周转为主（83.4%），但组合间差异不显著，进一步证实其随机性。
**3.4 物种累积曲线**
C|BT组合在12个样本中累积检测到45个OTU（占所有方法总检测的88%），远高于其他组合（C|ZY为25个，P|ZY为22个），但所有曲线均未达到平台期，表明12个滤膜不足以捕获全部脊椎动物多样性。
**讨论与结论**
本研究结果表明，布质滤膜与Blood & Tissue提取试剂盒的组合（C|BT）在物种丰富度、信息性物种检测、群落完整性和重复样本间一致性方面均优于其他组合。布质滤膜的成功可能归因于其较大的表面积（7.5×7.5 cm）以及缺乏粘性介质（粘性介质可能抑制提取和PCR）。石蜡纱布和PCR板封口膜表现较差，后者因非特异性扩增被排除。家庭物种的普遍检测可能源于通用引物对高丰度DNA的偏好性扩增，而信息性物种的随机分布则反映了空气颗粒的随机性。研究建议，为减少成本并提高方法可扩展性，应优先使用被动空气DNA收集方法。未来优化方向包括使用分子级水替代PBS以减少PCR抑制，以及开发通用探针用于精确DNA定量。本研究的结论是：C|BT组合（1）记录到更高的物种丰富度（每滤膜和总体），（2）检测到更多信息性非家庭物种，（3）获得更完整的物种群落，以及（4）重复样本间具有高一致性。该优化方法显著提升了被动空气DNA技术的性能，为其与传统监测方法（如相机陷阱、生物声学或水生eDNA）的并用提供了关键支持。论文发表在《Ecology and Evolution》。
