微生物功能潜力的空间分区表明地下河口存在复杂的氮循环

《Environmental Microbiology》：Spatial Partitioning of Microbial Functional Potential Suggests Complex Nitrogen Cycling in a Subterranean Estuary

　　

地下河口（STEs）是关键的生物反应器，调节着到达海岸生态系统的地下水衍生氮（N）的数量和化学组成。然而，这些地下水-海水混合带中微生物对N循环的控制仍知之甚少。研究人员调查了一个高N浓度的地中海冲积层STE内微生物群落及其N循环潜力的时空变化。研究人员探究了在冬季和夏季从不同深度和距海岸线距离采集的地下水样本中微生物丰度、异养活性、分类组成以及N循环基因丰度的变化。微生物丰度、活性和多样性根据物理化学和含水层深度在不同水化学带中变化显著，但季节性变化有限。功能预测表明，存在一套由占据不同STE区域的多种分类群编码的复杂、空间结构化的N途径，定量PCR（qPCR）揭示了氨氧化古菌（在淡地下水中普遍存在）与细菌反硝化菌（富集于深层咸水层）之间的生态位分化。多元线性模型预测显示，使用微生物属性比使用环境变量对NO₂^?和NH₄⁺浓度的拟合更好，突出了它们对理解STE中N循环的重要性。研究人员的结果表明，STE微生物组的功能潜力是复杂的，且在不同水化学带上呈空间结构化，解释了STE N循环的空间变化。

地下河口（Subterranean Estuaries，STEs）是地下水与海水混合的隐蔽过渡带，微生物驱动其中复杂的氮（N）循环转化，决定通过海底地下水排放（SGD）输入沿海生态系统的氮形态与通量。然而，现有研究多聚焦于STE微生物分类组成，对其功能潜力（特别是氮循环相关基因）的空间分布与调控机制认知不足。为填补这一空白，研究人员在西班牙东北部Argentona沿海冲积层含水层（高硝酸盐浓度，N污染背景）开展研究，该场地配备19个测压管，可高分辨率覆盖不同深度与距海岸线距离，完整呈现淡水-海水混合梯度。研究人员在冬季（2021年12月）和夏季（2022年7月）两次采集地下水、海水及表层土壤样本，系统分析微生物丰度、异养活性、分类组成，并通过16S rRNA基因扩增子测序结合PICRUSt2预测氮循环功能基因，qPCR定量关键基因（氨单加氧酶基因amoA、亚硝酸盐还原酶基因nirK和nirS），最后运用多元线性回归（MLR）模型评估微生物变量对氮浓度预测的贡献。研究发现STE微生物组功能潜力沿水化学带呈显著空间结构化，多种氮代谢途径（硝化、反硝化、DNRA、固氮、厌氧氨氧化、同化性硝酸盐还原等）由不同分类群编码并占据不同生态位，且微生物变量（如原核丰度、HNA细胞比例、预测基因丰度）比理化环境变量能更好地解释NH₄⁺和NO₂^?浓度的空间变异，揭示了微生物对STE氮循环的关键调控作用。该成果发表于《Environmental Microbiology》。

**关键技术方法**：研究基于西班牙Argentona沿海冲积层含水层（19个测压管，覆盖不同深度与距海岸线距离）的样本队列；采用流式细胞术测定原核总丰度与高核酸含量（HNA）细胞比例，通过³H-亮氨酸掺入法（冬季）和BONCAT（夏季）评估异养活性；对16S rRNA基因V4-V5区进行Illumina MiSeq测序，经DADA2处理获得扩增子序列变异体（ASVs）；利用PICRUSt2基于ASV预测KEGG直系同源物（KOs）以推断氮循环功能基因相对丰度；通过qPCR定量氨氧化古菌（AOA）的amoA基因及反硝化菌的nirK和nirS基因绝对拷贝数；最后采用多元线性回归模型比较环境变量（pH、温度、盐度、氧化还原电位、溶解氧）与微生物变量（原核丰度、%HNA、13个氮循环KOs的相对丰度）对氮浓度（NO₃^?、NO₂^?、NH₄⁺、DON、DOC）的预测能力。

**3.1 地下河口水化学空间变异**
通过k-means聚类将样本划分为四个水化学簇：淡水浅层（Fresh_S）、淡水深层（Fresh_D）、咸水层（Saline）和海水。咸水层盐度高、溶解氧和氧化还原电位低，NO₃^?和DON浓度低，但NO₂^?和NH₄⁺浓度高；淡水深层溶解氧和DOC高于淡水浅层，NH₄⁺浓度低。保守混合分析显示NO₃^?在各地下水簇中均呈净消耗，NH₄⁺和NO₂^?在咸水层和淡水浅层呈净产生，DOC在淡水浅层和部分咸水点呈净产生，揭示STE内活跃的生物地球化学转化。

**3.2 原核丰度与异养活性的时空变化**
咸水层原核总丰度最高（0.69–6.1×10⁵ cells mL^?1），HNA细胞比例及异养活性也最高；淡水深层丰度最低，活性最低；淡水浅层处于中间。季节性差异不显著，但咸水层夏季丰度较冬季几乎翻倍。

**3.3 微生物群落结构与分类组成**
NMDS分析显示群落组成按水化学簇显著分离（ANOSIM R=0.82），与海水和土壤明显不同，季节效应不显著。ASV丰富度在STE内（平均2300）远高于海水（740），淡水浅层最高（2900），咸水层最低（1600）。分类组成上，STE地下水以Patescibacteria、Nanoarchaeota、Thermoproteota、Verrucomicrobiota等为主，而这些类群在邻近土壤和海水几乎缺失，且各类群相对丰度随深度变化。指示ASV分析进一步支持类群的空间分区。

**3.4 氮循环功能潜力的预测**
PICRUSt2预测的13个氮循环KOs相对丰度呈显著簇特异性（ANOSIM R=0.48）。反硝化基因nirK在淡水深层最高（平均65%），而nirS和nosZ在咸水层最高（10%和18%）；硝化基因amoA在淡水深层最高（15%），hao在淡水浅层最高（13%）；DNRA基因nirB和nirD普遍存在，且随深度增加；固氮基因nifH也在咸水层峰值（13%）。同化性氮路径基因（glnA、gltB等）丰度极高。功能冗余分析表明，多数功能由多个门类共同编码，但amoA主要归属Thermoproteota，hao在淡水层由Planctomycetota主导，在咸水层由Gammaproteobacteria主导。

**3.5 氨氧化菌与反硝化菌的qPCR分布**
qPCR证实amoA基因拷贝数在淡水层最高（平均9.5×10⁵ copies L^?1），而nirK和nirS在咸水层最高（分别52×10⁵和48×10⁵ copies L^?1），与PICRUSt2预测趋势基本一致，但nirK预测峰值在淡水深层而非咸水层。季节性变化较小，但淡水深层nirK夏季显著增加，淡水浅层nirS夏季显著下降。咸水层中nirS在夏季成为主导亚硝酸盐还原酶基因。

**3.6 微生物功能潜力与地下水化学的关联**
qPCR基因丰度与环境变量的相关分析显示，amoA与NO₃^?正相关，nirK和nirS与DO、ORP、NO₃^?负相关，与DON、NO₂^?、NH₄⁺正相关。多元线性回归表明，仅基于微生物变量（原核丰度、%HNA、13个基因预测相对丰度）的模型能解释NH₄⁺、NO₂^?和DOC变异的大部分，优于仅基于环境变量的模型；对于NO₃^?和DON，两者解释力相当。结合环境与微生物变量时模型性能略有提升，其中nirK、nirS、nosZ、nirB、nirD、gltS和nirA等基因是重要预测因子。

**讨论总结**：研究揭示STE微生物群落的空间异质性主要由物理化学梯度驱动，而非季节变化。深层咸水层的高微生物丰度、活性与DNRA潜力增加一致，表明DNRA可能超过反硝化成为该区域主要的硝酸盐还原途径，从而产生NH₄⁺。同化性硝酸盐还原和异养氨同化基因的普遍存在提示微生物氮同化是重要的氮汇。不同氮循环功能由多种分类群编码，体现功能冗余，但关键基因（如amoA、nirS）的类群组成具有簇特异性。qPCR与PICRUSt2结果基本一致，但nirK的差异提示引物覆盖度限制。将微生物信息纳入模型显著提升了对NH₄⁺和NO₂^?的预测能力，证明微生物指标对理解STE氮循环不可或缺。未来需结合宏基因组、宏转录组及过程速率测定以更精确量化氮转化。

**研究结论**：本研究证明地下河口微生物对氮循环的控制沿显著物理化学梯度呈空间结构化，且跨季节保持稳定。STE内微生物氮转化涵盖多种代谢途径（硝化、反硝化、固氮、DNRA、厌氧氨氧化、同化性硝酸盐还原和异养氨同化），这些途径在含水层中空间分离，并由广泛的分类群编码。硝化在淡水含氧区占主导，而DNRA潜力在深层咸水中超过反硝化，暗示DNRA在氮去除中的潜在重要作用。涉及硝酸盐和铵异养同化的基因丰度进一步揭示了其对调节海岸地下水化学的潜在但常被忽视的作用。最后，简单的微生物描述符（如原核丰度、%HNA）和特定功能基因可改善对溶解态氮形态的预测，突显微生物群落与生物地球化学过程的紧密耦合。总体而言，这种复杂性强调需要更深入的微生物学知识，以更好地约束海底地下水排放中的氮转化与通量。