利用创新分离技术提取芦荟纳米囊泡及其在环境胁迫条件下的稳定性评价

《Plant Nano Biology》：Extraction Aloe vera nano-vesicles using inventive isolation techniques and evaluation of their stability under environmental stress conditions

　　

本研究尝试使用网筛过滤（80 μm）、膜过滤（100 kDa）、超速离心、梯度分离及其组合方法，从芦荟（Aloe vera）中分离纳米囊泡（ADNV）。研究人员对分离得到的ADNV进行了粒径分布、zeta电位、抗氧化活性及微观结构的评估。研究发现，结合膜过滤和在2250 g下离心30分钟的分离技术最适合ADNV的提取。分离后的ADNV被置于不同的环境胁迫条件下，即热胁迫（4°C/30分钟；37°C/30分钟；巴氏杀菌处理72°C/1分钟；煮沸处理96°C/10分钟；以及121°C/15分钟）和pH变化（1.5、7和8），以评估其稳定性。随着热处理强度的增加，ADNV的粒径显著增大（p<0.05），多分散指数（PDI）在煮沸和灭菌处理后分别达到0.92和1.00。另一方面，将样品调节至pH 1.5和8时，粒径和PDI值均有所降低。在pH 1.5条件下，ADNV获得了最高的zeta电位（-17.03 mV）。所有ADNV样品的抗氧化活性随热处理强度增加以及在较高pH（7和8）条件下均显著降低（p<0.05）。FESEM图像显示，ADNV的结构完整性保持完好，因此它们能够耐受所施加的环境胁迫条件。

**论文解读：芦荟纳米囊泡的创新分离技术及其环境胁迫稳定性研究**

**研究背景与动机**
细胞外囊泡（EVs）是几乎所有生物体（包括动物和植物）释放的纳米级颗粒，参与细胞间通讯并携带蛋白质、脂质、RNA等生物分子。植物来源的纳米囊泡（PDVs）在生长、组织修复和防御病原体等过程中发挥关键作用，且因低细胞毒性、低免疫原性和抗氧化活性，在食品和医药领域具有巨大应用潜力。然而，PDVs的分离纯化面临挑战：其尺寸小、易受非EV组分（如蛋白质、细胞碎片）污染。现有方法如超速离心（UCF）虽常用，但存在共分离杂质、高离心力损伤囊泡结构等问题，且缺乏标准化、可放大的分离方案。芦荟（Aloe vera）作为广泛应用的药用植物，具有抗炎、抗氧化等多种功效，但其纳米囊泡（ADNV）的分离与稳定性研究极为有限。因此，本研究旨在标准化芦荟纳米囊泡的分离工艺，并评估其在食品加工常见环境胁迫条件（温度和pH）下的稳定性，为开发基于植物的功能性食品成分提供依据。

**主要技术方法**
研究人员从印度卡纳尔（Karnal, Haryana, India）本地市场采购新鲜芦荟，经清洗、去皮、匀浆、纱布过滤后制得芦荟汁。采用五种分离方法：网筛过滤（80 μm）结合高速离心（3730 g、10000 g）、膜过滤（100 kDa）结合不同离心力（2250 g、65000 g）及梯度密度分离（蔗糖/Percoll）。通过动态光散射（DLS）测定粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位，利用FESEM观察形貌，采用Lowry法和蒽酮法测定蛋白质和碳水化合物含量，ABTS法评估抗氧化活性。稳定性测试中，ADNV分别暴露于不同温度（4°C、37°C、72°C、96°C、121°C）和pH（1.5、7、8）条件。

**研究结果**

**3.1 芦荟汁的近似组成与pH**
芦荟汁含水量为96.58±0.27%，碳水化合物（干基）52±0.62%，灰分15.43±0.45%，蛋白质7.17±0.03%，脂肪0.71±0.02%，pH 5.36±0.02。与文献报道一致，细微差异归因于品种和生长条件。

**3.2 ADNV的分离与表征**
通过不同方法分离的ADNV粒径范围为53.94±0.08 nm至567.24±0.48 nm。方法T1（网筛过滤+3730 g离心+65000 g梯度分离）获得最小粒径（53.94 nm），归因于中间差速离心和梯度分离有效去除了杂质。方法T5（2250 g膜过滤30分钟）获得粒径410.70 nm，但操作简便、成本低，被选为后续研究的最优方法。FESEM显示ADNV呈球形，粒径100-200 nm，符合exosome-like结构。蛋白质和碳水化合物含量分别为0.15%-1.5%和0.2%-0.35%，抗氧化活性（TAE）为311.99-1006.96，其中T3处理活性最高，可能源于多酚、多糖等生物活性分子。

**3.3 ADNV在环境胁迫条件下的稳定性**
**热胁迫影响**：热处理显著改变ADNV的粒径、PDI、zeta电位和抗氧化活性。低温（4°C/30 min）和高温（72°C/1 min、100°C/10 min、121°C/15 min）均使粒径显著增大（从约410 nm增至1270 nm），PDI在煮沸和灭菌后达0.92和1.00，表明颗粒聚集。zeta电位仅在煮沸时显著升高（-12.9 mV）。抗氧化活性随温度升高依次降低：对照 > 4°C > 37°C > 72°C > 煮沸 > 灭菌。FESEM证实高温处理使ADNV呈增大球形。加热导致动能增加，克服静电排斥，引起聚集；同时蛋白质变性暴露结合位点，加剧聚集。

**pH变化影响**：pH 1.5和8时，ADNV粒径减小（230-280 nm），PDI较小（pH 1.5时0.28），zeta电位在pH 1.5时最高（-17.03 mV）。pH 7时粒径最大（534 nm）、PDI最高（0.67）。抗氧化活性在所有pH下均保持较高（>700 TAE），但pH 7和8时略低于对照和酸性条件。FESEM显示pH 1.5和8时ADNV呈球形、尺寸较小，表明紧密的质膜保护了结构完整性。酸性条件下蛋白质沉淀可能降低粒径，与文献中部分结果不一致，可能源于囊泡来源和表面组成差异。

**结论与讨论**
本研究建立了芦荟纳米囊泡（ADNV）的分离方法，其中膜过滤（100 kDa）结合2250 g离心30分钟是简便、可放大的最优方案。环境胁迫（热处理和pH变化）虽显著改变ADNV的粒径、PDI、zeta电位和抗氧化活性，但FESEM证实其结构完整性保持完好，表明ADNV能耐受食品加工中的常见条件。研究结果支持ADNV作为功能性食品成分的潜力，可用于递送抗氧化活性物质。未来需阐明影响ADNV稳定性和功能性的分子机制，并优化大规模生产和储存条件，以推动其在食品和营养保健品中的实际应用。