斑马鱼幼鱼全脑分布神经元的电压成像

《Nature Methods》：Voltage imaging of neurons distributed across entire brains of larval zebrafish

　　

摘要
神经元在遍布全脑的网络中相互作用。尽管大量研究致力于全脑钙成像，基因编码电压指示剂（genetically encoded voltage indicators, GEVIs）的进展提出了一个问题：是否有可能对全脑范围内的神经元电压进行成像？实现这一目标需要具备高体积成像速率和信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）的显微镜。研究人员在此展示了一种远程扫描光片显微镜，能够以200.8 Hz的体积成像速率，对遍布斑马鱼幼鱼大部分脑区的表达基因编码电压指示剂的神经元进行成像。研究人员测量了约全脑四分之一神经元的电压轨迹。研究人员发现，在某一序列中不同时间放电的神经元占据不同位置：视觉诱发的序列映射到视顶盖（optic tectum），而刺激无关的爆发性放电则映射到小脑和延髓。对分布于多个脑区的神经元进行电压成像，可能为理解基本神经系统的运作开辟新的前沿。

基于《Nature Methods》论文的学术解读

**研究背景与科学问题**
神经系统功能依赖于分布在脑内不同区域的大规模神经元网络的协同活动。为理解这些网络如何产生感知、认知和行为，需要以足够高的时间分辨率监测大量神经元的动态活动。光学显微镜和基因编码钙指示剂的进步使研究人员能够对斑马鱼幼鱼全脑进行钙成像，因为钙离子浓度变化可以作为神经活动的间接指标。然而，全脑钙成像的时间分辨率通常在数百毫秒量级，无法解析毫秒级的神经过程，例如单个动作电位的精确时序和快速神经动力学。基因编码电压指示剂为实现并行监测多个神经元的膜电位提供了前景。然而，对遍布全脑的GEVI表达神经元进行成像，需要显微镜同时满足多项技术要求：时间分辨率需与动作电位的毫秒级时间尺度相匹配；三维视场需覆盖整个斑马鱼幼鱼脑；空间分辨率需足以分辨单个细胞；信号保真度需足以检测单个动作电位。优化其中一项指标往往会损害显微镜在其他方面的性能。因此，一个关键的科学问题在于：能否设计出一种显微镜，通过同时满足所有这些标准，跨越对斑马鱼大部分脑区神经元进行电压成像的可行性门槛。

**研究目标**
该研究旨在开发一种优化的远程扫描光片显微镜，实现对斑马鱼幼鱼大部分脑区（约85%体积）神经元的电压成像，并以200.8 Hz的体积成像速率，检测分布在全脑范围内、表达基因编码电压指示剂的神经元的活动。研究进一步希望探索这种方法能够揭示何种大型神经群体活动模式。

**主要方法与技术**
研究人员开发了一种远程扫描光片显微镜，其核心技术包括：使用超轻量化镀银反射镜（质量约0.01 g）配合压电弯曲驱动器（行程270 μm，共振频率930 Hz），实现高达300 Hz的轴向扫描；通过光学模拟优化镜筒透镜和继镜组合，在数值孔径为1.0条件下保持衍射极限的Φ900×200 μm3三维视场；采用Gpixel GSPRINT4502 CMOS图像传感器设计高速相机，并配合双相机分布式平面成像策略，实现512×1280像素视场下7300 Hz的有效帧率；加入双远程扫描模块，利用偏振光路恢复正交偏振荧光，将荧光收集效率提高75%。为消除血流引起的移动条纹伪影，研究人员采用了三种策略：瞬时心脏停搏、共振扫描光片摇摆和计算学排除受影响区域。主要数据依赖于计算学方法。样本为5–6天受精后（days post-fertilization, dpf）的斑马鱼幼鱼，使用Tol2转座系统和Gal4/UAS系统建立全神经元表达Positron2-Kv的转基因品系。

**研究结果**

**显微镜设计与实现**
研究人员通过光学模拟，在NA=1.0条件下实现了Φ900×200 μm3的衍射极限三维视场，边缘波前误差为0.15λ RMS（550 nm）。压电驱动轻质反射镜的远程聚焦机制实现了200 μm轴向范围、300 Hz的扫描速率。通过FPGA控制的闭环校准，压电反射镜在200.8 Hz下以近似三角波波形运动（由前三个傅里叶分量组成），实现了均匀的轴向采样。光片与移动焦平面同步，每次曝光40 μs，在206 μm厚度体积内获得30个均匀间隔的z平面，体积成像速率为200.8 Hz。

**条纹伪影的表征与缓解**
在原始光片电压成像数据中，研究人员观察到平行于 illumination轴（y轴）的明暗条纹图案。对照实验表明，静止条纹源于组织对光片传播的静态扰动（如折射率失配），不引入时间性伪影。移动条纹则源于血流对光片传播的动态扰动，会引发快速的基线波动，可模拟或掩盖神经放电。通过计算学方法识别并排除受移动条纹影响的ROI，可保留59–92%的分割ROI，获得无伪影的电压信号。

**显微镜性能**
在比较了ASAP3-Kv、Voltron2-Kv、Ace-mNeon2-Kv、pAce-Kv和Positron2-Kv五种GEVI后，研究人员选用Positron2-Kv，因为其具备高单动作电位信噪比。成像覆盖930×370×170 μm3体积，30个z平面，轴向步长5.86 μm。单个z平面的1000 Hz记录显示，下采样至200 Hz后约30%的动作电位被遗漏，这与Positron2-Kv亚毫秒级动力学一致。仿真表明，具有约2.6 ms去极化和4.3 ms复极化时间常数的较慢指示剂可在200 Hz下恢复99.7%的放电事件。光毒性检测（cleaved caspase-3、γH2AX、NeuN、synaptophysin免疫染色）显示暴露组与对照组无显著差异，表明可进行持续性成像。

**全脑大部分区域神经元电压活动的成像**
对4条斑马鱼（鱼A–D）进行UV视觉刺激实验，以200.8 Hz记录35秒，其中10秒给予UV刺激。通过Cellpose v.3.0深度学习模型和人工修正分割ROI，经计算排除受条纹伪影影响的区域后，每条鱼保留12,935–19,039个假定神经元（产量59–92%）。UMAP降维和DBSCAN聚类识别出三组神经元：组1神经元在刺激起始后发放增加，约92%位于视顶盖；组2神经元表现出与刺激无关的重复性爆发活动，约90%位于后脑；组3神经元无明显时间结构，广泛分布。组1神经元的峰值放电潜伏期在两次试验间高度一致，且与视顶盖内侧–外侧位置相关：外侧神经元较早放电，内侧神经元较晚放电，形成约200 ms的时空序列。组2神经元的爆发序列在神经元的爆发内激活顺序高度一致。在鱼B和C中，大量最早放电的神经元集中在一个约20×110×40 μm3的紧凑体积内，可能位于菱脑节5附近，对应于MiD2网状脊髓神经元簇。

**讨论**
该技术使对分布在大脑大部分区域的神经元电压进行成像成为可能，为系统神经科学研究开辟了新机遇。结合感觉刺激和虚拟行为范式，该方法可用于研究脑-wide状态转换的回路机制、兴奋–抑制平衡的维持等问题。通过适当的光谱分离，可整合红移电压指示剂和蓝移光遗传学蛋白，实现对大规模神经群体活动的同步扰动和监测。当前成像速率受限于相机像素吞吐量，但利用现有光学设计，对较小三维视场可实现超过1 kHz的成像速率，全脑200 Hz与局部区域千赫兹成像可结合用于跨尺度研究。进一步的改进方向包括：增加第二个光片以照亮被眼睛遮挡的区域，使用更长波长激发和红移指示剂以减少散射，以及结合膨胀显微镜、神经元条形码和原位测序等技术实现结构与分子分析。大规模电压成像产生的庞大数据量也推动了对高效处理和分析算法的持续开发。

**结论**
研究人员开发了一种远程扫描光片显微镜（rsLSM），能够以200.8 Hz的速率对斑马鱼幼鱼大脑大部分区域分布的神经元进行电压成像，在保持细胞分辨率和足够信噪比的同时覆盖约85%的脑体积。通过该方法，研究人员记录了约全脑四分之一神经元的电压活动，揭示了视觉刺激诱发的、从视顶盖外侧到内侧的时空序列性放电模式，以及小脑和延髓中刺激无关、但具有一致性时序结构的爆发性活动。这项工作代表了全脑电压成像领域的一个重要里程碑，表明对分布在大范围脑区的神经元电压进行成像已具备可行性，并为理解神经系统的基本运作机制提供了新的研究途径。