粪肠球菌GP-1764诱导鸡肠道中与细胞免疫应答和肠道屏障功能相关的关键通路早期差异基因表达

《Poultry Science》：Enterococcus faecalis GP-1764 induces an early differential gene expression in the intestine on key pathways related to cellular immune response and gut barrier function in chickens

　　

本研究的目的是通过分析全基因组基因表达及其与饲喂富含非淀粉多糖（NSP）日粮的鸡肠道微生物群的相互作用，阐明粪肠球菌（Enterococcus faecalis）GP-1764在起始阶段改善生产性能的作用模式。在第7天，研究人员分析了对照组（Ctrl）和试验组（EntF）之间回肠和盲肠内容物的微生物群以及空肠和盲肠黏膜的转录组。微生物群分析结果表明，EntF改变了回肠（中性β-多样性指数：p = 0.006；系统发育β-多样性指数：p = 0.006）和盲肠（系统发育β-多样性指数：p = 0.017）的β-多样性指数。转录组学显示，与对照组相比，EntF组空肠黏膜中有43个差异表达基因。其中，MHCY-36（MHC-I相关）、RAG2和MUC19样基因在EntF组中上调，这些蛋白编码基因具有免疫调节能力，这一结果得到了基因集富集分析（GSEA）和Cytoscape-ClueGo通路分析的支持。结果表明，肠道免疫调节是通过EntF合成的B族维生素代谢物呈递给鸡体内一种尚未描述的、类似于哺乳动物黏膜相关恒定T（MAIT）细胞的先天样非经典T淋巴细胞亚群而诱导的。这些细胞可能有助于炎症过程后的抗菌反应和受损屏障组织的修复。在回肠黏膜中观察到的MUC19样基因表达上调可通过促进杯状细胞产生黏液来保护肠道完整性。最后，参与B细胞和T细胞中V(D)J编码片段重组的RAG2可能提供更强的异物识别能力，使动物能够有效抵抗病原感染。综上所述，这些结果表明EntF在促进动物快速应对病原攻击能力方面发挥重要作用，从而诱导对具有抗营养活性、引起鸡中度炎症的日粮成分产生耐受性。

**论文解读文章**

**研究背景与目的**

家禽生产对于满足全球日益增长的动物蛋白需求至关重要，但抗生素的广泛使用导致了禽类病原菌抗菌素耐药性（AMR）的加剧，对公共卫生构成威胁。欧盟禁止将抗生素作为生长促进剂后，益生菌作为替代品被广泛研究，其能够减少肠道炎症、调节微生物群。另一方面，富含可溶性非淀粉多糖（NSP）的日粮会降低营养消化率、增加肠道黏度，并引发消化道炎症，进而降低家禽生产性能。研究人员的前期研究表明，益生菌可部分缓解NSP引起的营养消化吸收障碍，并使用富含NSP且不含酶的日粮作为挑战模型，以研究益生菌的免疫调节作用。然而，尽管益生菌在禽类生产中广泛应用，其调节宿主免疫系统的分子机制仍不清楚。粪肠球菌（E. faecalis）因其兼具益生和潜在致病（AMR）的双重特性而备受争议，需通过深度组学分析评估特定菌株作为益生菌的潜力。本研究旨在通过肠道黏膜的基因组-wide基因表达分析，阐明粪肠球菌GP-1764（EntF）在起始阶段的作用模式，探究其如何通过上皮应答和微生物群调节改善鸡的生长性能。

**研究内容与结论**

研究人员开展了体内试验，给肉鸡饲喂富含NSP的挑战日粮，并添加EntF益生菌（5×10⁷ CFU/只/天），在7日龄时采集回肠和盲肠内容物进行16S rRNA扩增子测序分析微生物群，同时采集空肠和盲肠黏膜进行RNA-Seq转录组学分析，并通过对EntF菌株进行全基因组测序和功能注释获得基因组推断功能特征（GIFT）。研究结论表明，EntF能够部分抵消NSP的挑战，促进肠道屏障保护、肠道健康和营养吸收，最终解释生产性能的改善。空肠黏膜中MHCY-36基因的上调，可能通过呈递由EntF合成的B族维生素代谢物，激活一种尚未描述的、具有抗菌活性和组织修复能力的先天样T细胞亚群，驱动细胞免疫应答向组织稳态和修复方向转变。此外，MUC19样基因的上调促进黏液生成，保护肠道完整性；RAG2基因的上调增强抗原识别能力。该研究发表在《Poultry Science》。

**主要技术方法**

本研究采用的技术方法包括：1）基于16S rRNA扩增子测序（V1-V3区）的微生物群分析，对回肠和盲肠内容物进行α-和β-多样性评估及差异丰度分析（ANCOM-BC2）；2）基于RNA-Seq的转录组学分析，对空肠和盲肠黏膜进行差异基因表达分析（limma和EdgeR）及基因集富集分析（GSEA）和Cytoscape-ClueGo通路分析；3）对EntF菌株进行全基因组测序，通过宏基因组组装和分箱获得MAG，利用DRAM进行功能注释，并通过DistillR获得基因组推断功能特征（GIFT）。样本来源于前述试验的空肠和盲肠黏膜及内容物，动物饲养符合伦理标准。

**研究结果**

**Probiotic Effects on Cecal and Ileal Microbiota Diversity and Enrichment at day 7**
通过16S rRNA测序分析，在7日龄时，EntF组与对照组相比，回肠和盲肠的α-多样性（丰富度、中性指数、系统发育指数）无显著差异。但β-多样性分析显示，EntF显著改变了回肠的中性（p=0.006）和系统发育（p=0.006）β-多样性指数，以及盲肠的系统发育（p=0.017）β-多样性指数。在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）在两个肠道段均为优势菌门。在ASV水平，回肠中EntF组富集了2个乳杆菌属（Lactobacillus）ASV，而对照组富集了8个ASV（包括乳杆菌属、Negativibacillus等）。盲肠中EntF组有19个ASV富集，主要来自毛螺菌科（Lachnospiraceae）；对照组有7个ASV富集。属水平分析显示，EntF组特有10个属，包括Intestinibacter、Hydrogenoanaerobacterium等；对照组特有7个属，包括变形菌属（Proteus）和克雷伯菌属（Klebsiella）等潜在致病菌。

**Gene Set Enrichment Analysis and functional analysis of core genes detected**
GSEA分析显示，在空肠黏膜中，EntF组上调了与适应性免疫系统（Adaptive_Immune_System）和内质网-高尔基体运输（ER to Golgi apparatus transport）相关的通路，而下调了与细胞周期（Cell Cycle）相关的通路。盲肠黏膜中未发现显著差异通路。Cytoscape-ClueGo分析进一步揭示，适应性免疫系统通路中富集了与免疫应答激活细胞表面受体信号通路、T细胞活化调节等相关的基因，表明EntF能够通过表面受体信号通路引导T细胞应答。

**Differentially expressed genes between EntF vs Ctrl groups identified by EdgeR**
EdgeR分析在空肠黏膜中检测到37个差异表达基因（DEs），其中上调的免疫相关基因包括MHCY-36（FC=85.63）、RAG2（FC=47.18）和MUC19样基因（FC=12.34），而下调的包括CLDN18（FC^-1=268.73）。在盲肠黏膜中检测到14个DEs，其中上调的包括ALPI（FC=6.10）和AvBD10（FC=11.63），表明EntF促进了肠道稳态维持和先天抗菌能力。

**Genome-inferred functional traits (GIFT)**
EntF菌株的基因组重建完成度为99.98%，功能注释显示其具有合成短链脂肪酸（SCFA）、维生素（包括B₉和B₂）以及降解多糖、氨基酸等代谢能力，这些功能与肠道健康和免疫调节相关。

**讨论与结论**

讨论部分指出，EntF对生产性能的改善未伴随α-多样性显著变化，但β-多样性的改变表明微生物群落组成和结构发生实质变化。回肠中益生菌解释了更大比例的微生物变异，而盲肠中检测到更多差异丰度ASV，这可能与固有菌群复杂性有关。EntF促进的乳杆菌属、丁酸球菌属（Butyricicoccus）等有益菌富集，以及对照组中条件致病菌（如变形菌属）的缺失，支持了益生菌的保护作用。GIFT分析证实EntF具有合成维生素和SCFA等代谢功能。转录组学结果结合GSEA和Cytoscape分析，提示EntF通过MHCY-36呈递维生素B代谢物，激活一种类似哺乳动物MAIT细胞的鸡先天样T细胞亚群，该细胞可能具有抗菌和组织修复功能。MUC19样基因上调可能通过非组成型途径促进杯状细胞分泌黏液；CLDN18的下调则可能反映了EntF通过减轻NSP引起的亚临床炎症，从而降低了对紧密连接修复的需求。盲肠中ALPI和AvBD10的上调进一步支持了肠道屏障保护和先天免疫增强。

结论部分翻译如下：当前结果表明，在肉鸡早期日粮中添加EntF益生菌能够部分抵消NSP的日粮挑战，促进肠道屏障保护、肠道健康和营养吸收，最终解释了生产性能的改善。空肠黏膜中MHCY-36基因表达的上调，该分子负责呈递由粪肠球菌合成的维生素B代谢物，可能能够激活一种尚未描述的、具有抗菌活性并驱动细胞免疫应答向组织稳态和修复方向转变的先天样T细胞。这些发现也可能归因于肠道微生物群落组成和结构的实质性变化，但微生物群变化与宿主差异表达基因之间的联系尚未完全阐明。未来需要进一步研究来验证这些初步假设。