综述：硼酸类β-内酰胺酶抑制剂：对抗抗菌素耐药性（AMR）的一种有前景的策略

《Medicinal Research Reviews》：Boronic Acid Inhibitors of β-Lactamases: A Promising Strategy Against Antimicrobial Resistance

　　

抗菌素耐药性（AMR）的上升对全球健康构成了严重威胁，这主要归因于β-内酰胺酶（β-lactamases）的扩散，该类酶负责使β-内酰胺抗生素（β-lactam antibiotics）失活。在恢复β-内酰胺疗效的众多策略中，使用β-内酰胺酶抑制剂（β-lactamase inhibitors, BLIs）是最有前景的策略之一，其中硼酸（boronic acid）衍生物已成为一个关键且化学结构多样的类群。这些化合物作为过渡态类似物（transition-state analogs），与丝氨酸β-内酰胺酶（serine β-lactamases, SBLs）的催化丝氨酸形成可逆共价键，有效模拟了β-内酰胺水解的四面体中间体。其缺电子的硼原子与可调的骨架相结合，使得效价、选择性和药代动力学性质得以精细调节。本综述追溯了从早期苯硼酸（phenylboronic acids）到下一代无环和环状衍生物的硼酸类BLIs的演进历程，重点介绍了关键的结构-活性关系、结合机制以及微生物学特征。讨论了已临床批准的药物如vaborbactam，以及处于研究阶段的化合物包括taniborbactam、xeruborbactam和benzoxaboroles，内容涵盖其治疗相关性和活性谱。特别关注的是它们抑制A类和C类酶的能力，同时当前的研究努力旨在将覆盖范围扩大到D类和金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamases, MBLs）。此外，本综述还探讨了创新方法，如动力学靶标引导合成（kinetic target-guided synthesis）和基于片段的设计（fragment-based design），以拓展硼酸药效团的化学空间。总之，这些进展突显了硼酸类BLIs作为克服β-内酰胺酶介导的耐药性并开发下一代抗菌疗法有力工具的潜力。

1 引言

1.1 β-内酰胺酶介导的耐药性

抗菌素耐药性（AMR）的惊人上升正将现代医学推向后抗生素时代，在这一不受欢迎的情景中，抗生素可能不再有效治疗常见细菌感染。在驱动这一危机的病原体中，耐药革兰阴性菌尤其令人关注，因为基因突变和水平基因转移（HGT）共同促成了多重耐药、广泛耐药和全耐药（MDR、XDR和PDR）病原体的出现。这些生物体导致了很大比例的医疗相关感染以及越来越多的社区获得性感染。值得注意的是，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌、耐氧亚氨基头孢菌素肠杆菌目（特别是肺炎克雷伯菌和大肠杆菌）以及耐碳青霉烯类肠杆菌目是与严重且难以治疗的感染最常相关的病原体，通常伴随高发病率和死亡率。这些耐药细菌损害了多种化学结构不同的抗生素类别的疗效，包括β-内酰胺类——其仍是最广泛用于治疗常见和严重细菌感染的药物。β-内酰胺类通过其催化丝氨酸残基的拟不可逆酰化作用发挥抗菌效果，该残基属于青霉素结合蛋白（PBPs, EC 3.4.16.4），这是一类对肽聚糖生物合成和细胞壁完整性至关重要的细菌DD-转肽酶。革兰阴性菌可通过多种机制对抗β-内酰胺抗生素活性，包括降低外膜通透性（孔蛋白突变）、主动外排（外排泵过表达）、靶标修饰（PBP突变），以及最重要的β-内酰胺酶的酶促药物水解。

β-内酰胺酶（EC 3.5.2.6）是一个保守但进化多样的细菌水解酶家族，能够通过裂解其特征性的四元环使β-内酰胺抗生素失活。通过有效地在靶标结合前中和β-内酰胺，β-内酰胺酶代表了克服该类抗生素最成功的细菌策略，因此是抑制剂开发的核心焦点。在革兰阳性菌中，β-内酰胺酶通常分泌到胞外环境或与细胞表面相关，而在革兰阴性生物中，它们通常定位于周质空间，在那里可以拦截β-内酰胺，防止抗生素到达PBP靶标。值得注意的是，一些酶（如NDM-1和某些OXA型碳青霉烯酶）偏离了这一模式，它们可以被脂化、与外膜相关并通过外膜囊泡输出，从而促进酶的稳定性和耐药性传播。

鉴于广谱青霉素和头孢菌素仍是最广泛使用的抗生素，产β-内酰胺酶革兰阴性菌的广泛传播对人类和动物健康构成了重大威胁，使临床、兽医和农业环境中的抗菌管理和耐药性控制复杂化。这种威胁因超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的传播而进一步放大，后者水解氧亚氨基头孢菌素，并且碳青霉烯酶的出现也加剧了这一威胁，碳青霉烯酶赋予对青霉素、头孢菌素、单环β-内酰胺和碳青霉烯的耐药性。

β-内酰胺酶可根据Ambler方案基于氨基酸序列同源性和活性位点结构分为四个不同的类别（A、B、C和D）。进一步的宏观分类源于负责这些水解酶催化特性的活性位点残基/原子，将A、C和D类定义为丝氨酸β-内酰胺酶（SBLs），而B类酶包括整个金属β-内酰胺酶（MBLs）域。这一区别在机制上很重要，因为SBLs与PBPs（β-内酰胺抗生素的生理靶标）共享关键的催化和进化特征。PBPs和SBLs都通过活性位点丝氨酸残基与β-内酰胺反应，反映了它们与祖先DD-肽酶的共同进化起源。然而，在PBPs中，产生的酰基-酶复合物是长寿命的并且经历非常缓慢的脱酰基化，从而阻断肽聚糖交联并损害细胞壁生物合成，而SBLs获得了通过加速酰基-酶中间体的分解来有效催化β-内酰胺水解的能力。相比之下，MBLs通过金属依赖机制催化β-内酰胺水解，其中一个或两个锌离子配位并激活水分子，负责攻击β-内酰胺环。PBPs、丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶之间的机制关系总结在方案1中。这种机制差异与抑制剂设计高度相关，因为大多数经典β-内酰胺酶抑制剂主要靶向SBLs，而开发对SBLs和MBLs均有效的化合物仍是一项重大挑战。

除了Ambler分类外，Bush-Jacoby（也称为Bush-Jacoby-Medeiros）功能分类根据底物谱和抑制剂易感性对β-内酰胺酶进行分组。在本综述中，Ambler分类被用作主要的组织框架，因为它更直接地与催化机制和抑制剂设计一致，而所讨论的主要酶对应的Bush-Jacoby组总结在表1中。

1.2 β-内酰胺酶抑制剂：当前和不断发展的格局

为了克服β-内酰胺酶的水解活性，研究者们采取了两种主要策略。第一种涉及设计新型或结构优化的β-内酰胺抗生素，以提高对酶降解的抗性。虽然这种方法取得了显著进展，例如开发了超广谱头孢菌素和碳青霉烯，但它本质上受到可探索的化学空间有限的制约，因为结构修饰局限于β-内酰胺骨架的相同区域。此外，研发工作所需的高成本、长时间和大资源往往使该策略不太实用和可行。

一种更靶向且被广泛采用的对抗β-内酰胺酶介导的耐药性的策略涉及开发针对β-内酰胺酶的特异性抑制剂。这些分子被称为β-内酰胺酶抑制剂（BLIs），本身通常表现出很少或没有内在抗菌活性，并作为佐剂。当与β-内酰胺抗生素共同给药时，它们保护抗生素免受酶降解，从而恢复其抗菌功效。这些抑制剂已成为对抗多重耐药革兰阴性菌治疗策略的基石，导致了各种已批准的β-内酰胺/BLI组合和目前正在临床试验中的几种其他组合。

1.2.1 β-内酰胺衍生的BLIs

第一代BLIs最初于1976年随着克拉维酸的发现而报道，还包括舒巴坦和他唑巴坦。最近，enmetazobactam（一种他唑巴坦的N-甲基化衍生物，前称AAI101）也获得了批准。这些β-内酰胺衍生分子通过酰化催化丝氨酸残基形成共价酰基-酶复合物，作为丝氨酸β-内酰胺酶的机制性抑制剂。这些中间体随后可重排成稳定的抑制物种。尽管它们在刚引入时提供了显著的临床益处，但这些经典抑制剂主要靶向A类β-内酰胺酶，对C类和D类酶效果较差。例如，克拉维酸（一种天然存在的氧青霉烷）已广泛与阿莫西林联合使用，而舒巴坦和他唑巴坦已分别与氨苄西林和哌拉西林联合配制。最近，头孢吡肟/enmetazobactam已证明对产ESBL和OXA-48的肠杆菌目有效，相对于哌拉西林/他唑巴坦具有改善的活性。

1.2.2 二氮杂双环辛烷（DBO）为基础的BLIs

β-内酰胺酶抑制的一个重大突破来自二氮杂双环辛烷（DBO）为基础的BLIs的开发。Avibactam（AVE1330A和NXL104）是2015年首个批准的DBO，开创了一种新的抑制机制，通过与SBLs的催化丝氨酸形成可逆共价键。这种可逆性表明药效团在抑制过程中不被水解，允许avibactam在多个催化循环中保留其抑制活性，尽管在D类酶中发生不可逆抑制，在A类KPC-2中发生去硫酸化。Avibactam对A类（即TEM、SHV和KPCs）、一些C类（AmpC）和有限的D类酶（不抑制OXA-24/40）表现出广谱活性。它被批准与头孢他啶联合使用，而氨曲南/avibactam也扩展了对产MBL肠杆菌目的覆盖范围。随后的DBO包括relebactam、nacubactam和zidebactam。Relebactam具有哌啶部分，与亚胺培南-西司他丁联合使用，主要靶向A类和C类酶。Nacubactam和zidebactam显示双重作用模式，结合β-内酰胺酶抑制与直接结合PBPs，从而增强抗菌活性。值得注意的是，zidebactam主要特征为高亲和力结合PBP2，这支撑了其独特的β-内酰胺增强剂特性。两者均在临床开发中：nacubactam与美罗培南（I期），zidebactam与头孢吡肟（III期）用于cUTIs和肾盂肾炎。Durlobactam（前称ETX2514）是下一代DBO，设计用于增强刚性和亲和力，特别是对D类碳青霉烯酶，同时保持对A类和C类β-内酰胺酶的抑制谱。与舒巴坦联合（Xacduro，FDA批准）被批准用于由鲍曼不动杆菌-醋酸钙复合体引起的医院获得性和 ventilator相关性细菌性肺炎。新一代DBO在临床试验管线中包括ETX1317（前药ETX0282）、funobactam（XNW4107）、pralurbactam（FL058）和ANT3310。这些药剂显示出对A、C和D类酶的有希望的广谱抑制，一些显示出对脓肿分枝杆菌和产KPC或OXA肠杆菌目的活性。尽管它们具有重大临床影响，但对DBO类抑制剂的耐药性正在出现，特别是在A类酶中。在KPC酶中，与耐药相关的替换包括KPC-2中的D179N和S130G，以及KPC-2和KPC-3衍生变体中的D179Y。此外，在CTX-M-15中组合的L169Q/S130G替换显著损害了avibactam的抑制。

1.2.3 硼酸为基础的BLIs

硼酸衍生物代表了BLIs领域的关键进展，这归功于其独特的作用机制。这些化合物作为酰化或脱酰基化过渡态类似物，模拟β-内酰胺水解过程中形成的高能四面体中间体。通过这种模拟，硼酸抑制剂与SBLs的催化丝氨酸残基建立可逆共价（配位）键，有效阻断酶活性位点。重要的是，尽管具有这种共价作用模式，硼酸可以实现对β-内酰胺酶相对于其他丝氨酸水解酶（包括哺乳动物丝氨酸蛋白酶）的显著选择性，这归因于β-内酰胺酶活性位点的互补结构和抑制剂骨架建立的定制相互作用。几个结构特征促成了硼酸的有效性。首先，硼与β-内酰胺羰基共享战略化学特征：两者都作为易受亲核攻击的亲电中心。其次，相对于反应中心的R₁侧链取代基的几何和立体化学排列在许多模拟β-内酰胺骨架的硼酸中通常紧密保守。在许多硼酸中，与亲电硼中心相邻的碳上带有酰胺功能，非常类似于青霉素和头孢菌素的C(6)或C(7)侧链，包括它们的立体化学构型。从化学角度来看，硼是一种缺电子的路易斯酸，具有空的p轨道，使其高度亲电。在硼酸中，B-O键显示部分双键特征和短键长，有助于整体分子稳定性。与肽键或β-内酰胺环不同，B-O键不易被细菌酶水解，使硼酸对酶降解更具抵抗力。在溶液中，硼酸通常存在于三角平面几何结构（sp²杂化）中，空的p轨道垂直于平面。在亲核攻击（例如催化丝氨酸的羟基介导）时，硼经历重杂化到sp³状态，形成四面体阴离子中间体。这种转变使硼酸能够模拟亲电β-内酰胺羰基和β-内酰胺水解过程中形成的四面体中间体，从而支撑硼基抑制剂的有效抑制活性和选择性。值得注意的是，过去几十年积累的大量生化、药理和临床证据也有助于消除早期对硼相关毒性的担忧，支持硼酸衍生物作为β-内酰胺酶抑制剂开发的可行且通常耐受性良好的化合物类别。

与β-内酰胺类抑制剂或DBOs不同，硼酸抑制剂具有灵活的化学骨架，允许精细调节药效学性质和广谱覆盖范围。Vaborbactam（本文中化合物59），一种与美罗培南联合使用的环状硼酸酯（Vabomere）的批准，标志着一个主要里程碑，特别是由于其对A类β-内酰胺酶（如KPC）和一些C类酶的高效力。虽然vaborbactam不抑制金属β-内酰胺酶，但其恢复碳青霉烯在产KPC肠杆菌目中疗效的能力突显了硼酸酯的临床价值。所有临床相关和研究性硼酸类BLIs的设计、特性和活性谱将在本综述以下部分全面描述和讨论。

2 讨论

2.1 无环硼酸衍生物

2.1.1 乙酰胺、羧酰胺和甘氨酸硼酸

一种设计有效抑制剂的仿生方法：使用无环硼酸作为BLIs的概念最早在20世纪90年代提出，当时Martin等人通过合理设计将β-内酰胺抗生素中的功能基团纳入无环硼酸骨架，从而合理设计了一种新型抑制剂。利用大肠杆菌TEM-1:PenG酰基-酶复合物的晶体学数据，基于结构的设计导致了(1R)?1-乙酰胺基-2-(3-羧基苯基)乙烷硼酸（化合物1）的开发，这是SBLs β-内酰胺水解催化机制中观察到的高能中间体的过渡态类似物。化合物1对A类TEM-1表现出强效抑制，K_i为110 nM。作者提出，连接到硼加合物的氧原子之一位于氧阴离子孔中，与S70和A237主链氮形成直接氢键，因此类似于酰基-酶复合物中羰基氧原子的位置。第二个氧的作用是取代脱酰基化水并与E166羧酸盐和N170酰胺侧链形成强氢键。此外，这篇手稿详细回顾了无环硼酸作为A类β-内酰胺酶共价抑制剂的机制，提示K73在β-内酰胺水解的脱酰基化步骤中起核心作用。具体来说，K73在脱酰基化过程中作为E166和S70之间的质子穿梭，这由与E166的强氢键（2.7 ?）证明。这也得到E166和S70之间距离大于4 ?的支持。

尽管化合物1的抑制谱最初未针对其他β-内酰胺酶进行评估，并且缺乏微生物学数据，但这项开创性工作为同一小组随后的骨架优化奠定了基础。使用合理设计方法，Ness及其同事开发了两种脱酰基化过渡态类似物衍生物：(1R)?1-苯基乙酰胺基-2-(3-羧基苯基)乙基硼酸（化合物2）和(1R)?1-乙酰胺基-2-(3-羧基-2-羟基苯基)乙基硼酸（化合物3）。为了增强母体化合物1的效力，引入了结构修饰以加强TEM-1活性位点内能量有利的相互作用。在化合物2中，侧链乙酰胺基被苯基乙酰胺基部分取代，模拟PenG的R-基团并增强与残基235-238的范德华和疏水接触。这种修饰导致抑制效力提高20倍（K_i = 5.9 nM）。相反，化合物3类似于1的结构，掺入了邻位酚羟基以增加氢键，特别是与残基S130，导致相对于母体化合物活性提高10倍（K_i = 13 nM）。这种仿生方法利用了β-内酰胺羰基和硼原子之间的结构和电子相似性，有效地将硼酸药效团靶向A类SBLs亲核丝氨酸的能力与β-内酰胺底物完善的侧链识别特征相结合。TEM-1与化合物2和3复合物的晶体学分析揭示了额外的未预期的相互作用，包括氢键形成、活性位点水分子的置换和侧链重排。有趣的是，这项研究首次提出化合物3可能诱导形成环状硼酸酯，从而为后续关于双环硼酸酯的工作奠定了基础。然而，图5B中显示的晶体结构并未揭示化合物3的双环硼酸酯形式。化合物2对A类β-内酰胺酶的抑制谱进一步被Rojas等人证实，证明对临床相关的SHV-1（IC₅₀ = 200 nM）和KPC-2（IC₅₀ = 70 nM）具有强效抑制。

在一项开创性研究中，Caselli等人通过关联适当衍化的酰基甘氨酸硼酸的亲和力与结合能，研究了控制β-内酰胺酶识别β-内酰胺的能量因素。通过用青霉素和头孢菌素的侧链修饰八种酰基甘氨酸硼酸，他们产生了一系列强效的硼酸过渡态抑制剂（BATSIs），并为未来的抑制剂设计奠定了基础。有趣的是，BATSIs之间的差分结合能（ΔΔG）提供了对关键酶-抑制剂相互作用的见解，如X射线晶体结构所证实。为了量化不同R₁侧链对酶结合的贡献，通过比较每种硼酸衍生物与参考化合物（乙酰胺甲基）硼酸的ΔΔG值。这种使研究人员能够评估单个侧链如何增强或减弱结合亲和力。硼酸抑制的可逆性使得能够与酰基-酶中间体进行结构比较，揭示了R₁识别如何从过渡态演变到共价结合的基态。这些结合差异通过评估每种衍生物对代表性C类SBL，大肠杆菌AmpC的抑制活性进行了功能验证。

大肠杆菌AmpC与带有氯唑西林（化合物4）和头孢噻吩（化合物5）R₁侧链的甘氨酸硼酸复合物的晶体结构表明，酰胺基团（β-内酰胺中的C6-C7）对结合至关重要，为自由能贡献了3.2 kcal/mol。有趣的是，分别带有萘夫西林和头孢他啶侧链的化合物6和7是最强效的。化合物6对AmpC的K_i为33 nM，而化合物7对AmpC达到20 nM，对TEM-1为390 nM。两者都增强了头孢他啶和头孢噻肟对耐药阴沟肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株的活性，展示了对革兰阴性和阳性菌的有希望的活性谱。这些硼酸对α-胰凝乳蛋白酶、β-胰蛋白酶和弹性蛋白酶等丝氨酸蛋白酶也显示出高选择性。

Chen等人的一项额外研究使用硼酸作为强大的分子探针，揭示了β-内酰胺酶识别和催化机制的关键细节。虽然带有青霉素和头孢菌素R₁侧链的甘氨酸硼酸可以作为酰化过渡态类似物，但具有额外R₂侧链的手性甘氨酸硼酸表现为脱酰基化过渡态类似物。此外，该报告证实这些衍生物与SBLs形成可逆的、快速结合/快速解离的加合物。

随后使用基于结构的方法在针对C类β-内酰胺酶的BATSI设计中取得了进一步进展。基于先前识别关键AmpC“热点”的工作，并采用仿生方法，开发了一系列间羧基苯基甘氨酰硼酸以增强抑制剂结合。遵循与甘氨酸硼酸相同的原理，引入了来自头孢噻吩和氯唑西林的侧链（R₁），同时在相同的硼承载碳原子上放置了间羧基苯基（R₂）。这导致了化合物8，一种强效的AmpC抑制剂（K_i = 1 nM），比缺乏R₂基团的母体分子提高了300倍。AmpC-8复合物的晶体结构分析突出了C3(4)′酸性基团在靶标识别中的关键作用。羧酸盐对结合贡献显著，与缺乏该基团的化合物9（K_i = 35 nM）相比得到证实。尽管8-和9-AmpC复合物之间的结构差异很小，但羧酸盐使结合自由能提高了2.1 kcal/mol，强调了其在抑制剂识别中的关键作用。在微生物学测定中，化合物8略优于9，对弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌的菌株将头孢他啶MIC值降低了8至32倍。化合物8以及更广泛的该抑制剂系列对AmpC也显示出相对于代表性丝氨酸蛋白酶的高选择性，比α-胰凝乳蛋白酶的选择性高5个数量级，并且在1 mM以下对β-胰蛋白酶没有可测量的抑制。由于残基N289在C类β-内酰胺酶中不保守，如在阴沟肠杆菌的P99酶中，Morandi等人研究了该位置的突变是否会影响化合物8的抑制活性。化合物8对AmpC N289A突变体显示出略微降低的效力（K_i = 17 nM）。为了解决这个问题，以8为起点进行了基于结构的优化，产生了化合物10。化合物10的设计旨在生成一个可以与N343、N346和T316形成的羧酸盐亚位点相互作用的骨架，取代与N289的相互作用。虽然10对野生型AmpC保持了高亲和力（K_i = 1 nM）并改善了对N289A突变体的结合（K_i = 2.8 nM），但它并没有超越8。AmpC-10复合物的晶体结构显示抑制剂羧酸盐仅与N343相互作用。

在随后的几年中，硼酸作为BLIs获得了越来越多的关注。虽然最初被用作研究β-内酰胺酶催化机制细节的分子探针，但一旦明确含硼化合物对人类没有固有的毒性，它们的角色就发生了显著演变。因此，硼酸从学术好奇心转变为可行的候选药物，引发了制药行业的兴趣，并促使开发更有效、选择性和药理学优化的抑制剂。这种日益增长的兴趣转化为对临床重要β-内酰胺酶（包括那些导致广泛耐药的酶）的更广泛测试。因此，对化合物8与临床相关C类酶ADC-7进行了进一步的结构和生化分析。化合物8强效抑制ADC-7（K_i = 21 nM），在表达bla_ADC-7的大肠杆菌DH10B中将头孢他啶活性提高了高达八倍。有趣的是，在ADC-7:8复合物中，化合物8采用了两种构象：一种与N340和N343形成氢键，另一种与S315相互作用。化合物8还对A类酶SHV-1和KPC-2显示出强效活性（IC₅₀分别为400 nM和600 nM）。除了其β-内酰胺酶抑制谱外，化合物8后来还被确定为一种有前景的铜绿假单胞菌生物膜抑制剂，抑制生物膜形成、毒力因子和群体感应相关的自诱导分子。

在本小节讨论的10种BATSIs中，化合物8作为最有希望的脱颖而出，对A类和C类β-内酰胺酶（包括AmpC、ADC-7、SHV-1和KPC-2）均表现出纳摩尔抑制活性。其强效的生化谱和增强β-内酰胺功效的能力，以及在铜绿假单胞菌中的抗生物膜和抗毒力作用，突显了其治疗潜力。然而，缺乏对B类和D类的效力，加上良好但并非卓越的微生物学谱，强调需要进一步骨架优化以解决靶标变异性。

2.1.2 磺酰氨基甲基硼酸

一种用于BATSIs的生物等排方法：2010年，默克研究人员引入了4,7-二氯-1-苯并噻吩-2-基磺酰氨基甲基硼酸（化合物11），作为第一个显示出对D类β-内酰胺酶抑制活性的BATSI。值得注意的是，化合物11抑制OXA-24/40的IC₅₀为5.6 μM，并展示了更广的抑制谱，对A类TEM-1（IC₅₀ = 1.1 μM）和SHV-5（IC₅₀ = 0.57 μM）、C类AmpC（IC₅₀ = 1.2 μM）和P99（IC₅₀ = 0.62 μM）均有活性。此外，化合物11能够降低过表达丝氨酸β-内酰胺酶的鲍曼不动杆菌菌株（CL6188）的亚胺培南MIC，突显了其作为广谱BLI骨架的潜力。

不久之后，Eidam等人引入了一系列新型磺酰胺硼酸作为BLIs，灵感来自应用于2.1.1节中描述的酰基甘氨酰硼酸骨架的生物等排方法。他们的原理基于两个关键观察：首先，在化合物8的结构中，羧酰胺氧和氮与AmpC中的N152和A318主链羰基形成氢键；其次，带有磺酰胺部分的非共价β-内酰胺酶抑制剂在AmpC活性位点中显示出类似的相互作用。在这些见解的指导下，他们合成并测试了10种磺酰胺硼酸，从而鉴定出化合物12（带有PenG侧链），对大肠杆菌AmpC显示出高效力（K_i = 70 nM）。

有趣的是，作者观察到在这些骨架中用磺酰胺基团替换羧酰胺基团导致亲和力提高高达23倍。该系列的一个重要发现是，更简单的磺酰胺侧链与更高的抑制活性相关；这与2.1.1节中讨论的基于羧酰胺的硼酸趋势相反。这些磺酰胺硼酸与氧亚氨基头孢菌素显示出强烈的协同作用。在过表达C类β-内酰胺酶的菌株中，它们成功恢复了头孢他啶和头孢噻肟的疗效，显著降低了MIC值。后来，AmpC与化合物13（K_{i AmpC} = 1.3 nM）结合的结构研究表明，磺酰胺硼酸保持了重要的相互作用，例如磺酰胺基团与残基N152和Q120之间的氢键，同时与羧酰胺类似物相比采用了不同的几何和极性。在ADC-7:13复合物中观察到类似的相互作用模式，其中鉴定出与N221、S320和T319的额外接触。化合物13还对其它C类变体显示出强效活性，包括ADC-7（K_i = 160 nM）和ADC-33（K_i = 57 nM）。这些数据也在表达bla_ADC-7的大肠杆菌DH10B中得到验证，其中化合物13将头孢他啶的MIC降低了高达64倍，显著增强了其微生物学疗效。重要的是，该系列中具有代表性的磺酰胺硼酸在100 μM时对α-胰凝乳蛋白酶或克鲁斯氏蛋白酶没有可测量的抑制，支持了该骨架超出β-内酰胺酶抑制的选择性。除了C类酶，13还对A类和D类SBLs显示出活性：13抑制SHV-1和KPC-2的IC₅₀值分别为430 nM和200 nM。令人惊讶的是，与其对化合物11的活性一样，其活性最近在D类OXA-24/40中得到验证（K_i = 4.4 μM）。然而，当13与各种头孢菌素和碳青霉烯联合测试对鲍曼不动杆菌菌株（包括表达OXA-24的分离株和携带不同OXA的临床菌株）时，未观察到显著的MIC改善。类似地，在具有ADC敲除和bla_OXA-24/?40构建体的鲍曼不动杆菌ATCC17978中，13只能轻微恢复易感性水平。使用OXA-24/40:13晶体结构作为参考合成了带有α-烷基取代的额外类似物，但没有一种优于化合物13。

Eidam等人使用基于片段的方法进一步优化了化合物13骨架，从而开发了迄今为止两种最强效的BATSIs：化合物14和15。基于先前的片段筛选和去片段化研究，作者鉴定了三个阴离子片段，它们占据了与化合物13羧酸盐部分相同的区域，但方向更有利，允许与G320的主链酰胺改善相互作用。用四唑部分替换羧酸在对位苯环上产生了，其中包括14（2-氯-4-四唑基苯磺酰胺硼酸），对AmpC表现出非凡的0.2 nM K_i，以及15（2-三氟甲基-4-四唑基苯磺酰胺硼酸），对同一酶显示出更有效的0.05 nM K_i。AmpC与14和15复合物的X射线结构揭示了三氟甲基或氯取代基与A318和T319主链羰基之间的范德华相互作用。

微生物学测试显示，两种化合物与头孢噻肟或头孢他啶联合使用，在50%过表达AmpC的临床分离株中降低了MIC值。对15的进一步评估显示，对头孢菌素酶ADC-7的K_i也达到了0.45 nM。当在表达bla_ADC-7的大肠杆菌DH10B和MDR临床菌株鲍曼不动杆菌M9中进行测试时，15将CAZ MIC分别降低了高达32倍和8倍。此外，这些片段优化的磺酰胺硼酸酯保持了对靶标的高选择性，对AmpC的亲和力通常比对代表性丝氨酸蛋白酶的亲和力高5-6个数量级。

在本小节描述的BATSIs中，化合物13作为一种有前景的磺酰胺硼酸抑制剂出现，对C类β-内酰胺酶显示出强效活性，并与第三代头孢菌素有显著协同作用。其优化衍生物化合物15具有皮摩尔抑制亲和力，并对C类酶具有选择性抑制，代表了迄今为止开发的最强效BATSI之一。尽管15在体外对C类表现出令人印象深刻的性能，但对D类酶的活性不太一致，并且对金属β-内酰胺酶无效，限制了其作为真正广谱解决方案的潜力。