来自固定诱导的萎缩肌肉的细胞外囊泡含有独特的microRNA谱并影响脑神经元的mRNA谱

《Physiological Reports》：Extracellular vesicles derived from immobilization-induced atrophic muscle of male mice contain distinct microRNA profiles and impact mRNA profiles in brain neurons

　　

由不活动导致的肌肉萎缩会引起多种生理功能下降，包括脑功能。尽管已知骨骼肌可分泌细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）如外泌体，但不活动诱导的肌肉萎缩如何改变这些EVs的性质和功能仍不清楚。在本研究中，研究人员探讨了石膏固定诱导的肌肉萎缩对小鼠骨骼肌来源EVs的microRNA（miRNA）谱的影响，以及它们对脑神经元转录组变化的影响。石膏固定诱导的肌肉萎缩显著改变了骨骼肌来源EVs的microRNA谱，与对照组相比，有25个microRNA上调，2个microRNA下调。此外，用萎缩骨骼肌来源的EVs处理脑神经元显著改变了神经元mRNA表达谱。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示，EV处理神经元中上调的mRNA富集于参与程序性细胞死亡（包括凋亡）正调控的基因。一致地，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析显示脑神经元中凋亡相关信号通路被激活。这些发现表明，肌肉萎缩诱导的骨骼肌来源EVs改变可能通过促进脑神经元凋亡过程而导致脑功能障碍。

**论文解读**

**研究背景与目的**
衰老和不活动导致骨骼肌质量与力量下降，增加肌少症和肌肉萎缩风险。流行病学分析显示，肌少症严重程度与认知功能损害密切相关，提示肌肉质量丢失可能是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的危险因素。动物实验表明，石膏固定诱导的肌肉萎缩可导致小鼠记忆损伤，但分子机制尚不明确。骨骼肌分泌多种生物活性物质，如激素、生长因子和细胞因子，其中细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）包含外泌体和微囊泡，可携带microRNA（miRNA）、蛋白质和脂质，通过血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）调控中枢神经系统。运动刺激可改变骨骼肌来源EVs的miRNA组成，而萎缩状态下EVs的miRNA谱变化及其对脑功能的影响尚不清楚。因此，研究人员旨在探究：石膏固定诱导的肌肉萎缩对小鼠骨骼肌来源EVs中miRNA表达谱的影响，以及这些EVs对脑神经元转录组的影响。

**研究内容与结论**
研究人员建立了小鼠后肢石膏固定模型，诱导肌肉萎缩14天，从腓肠肌组织培养上清中分离骨骼肌来源EVs，进行小RNA测序分析miRNA表达变化；同时，将EVs处理原代海马神经元，通过mRNA测序和功能富集分析评估神经元转录组响应。结果表明，固定萎缩组EVs中27个miRNA差异表达（25个上调，2个下调），其中miR-3473b、miR-206-3p、miR-381-3p、miR-671-5p、miR-671-3p和miR-208b-3p变化超过3倍。萎缩EVs处理神经元后，与对照EVs处理相比，197个mRNA差异表达（47个上调，150个下调），主成分分析显示组间分离。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析揭示，上调mRNA富集于程序性细胞死亡（包括凋亡）正调控通路，以及p53、MAPK、FoxO和凋亡信号通路。这些发现提示，废用性肌肉萎缩导致的骨骼肌来源EVs特性改变，可能通过诱导神经元凋亡参与脑功能障碍。论文发表在《Physiological Reports》。

**关键技术方法**
研究使用10周龄雄性C57BL/6小鼠（日本SLC提供），随机分为石膏固定组（n=6）和对照组（n=6）。固定14天后，取腓肠肌组织培养24小时，收集上清液，采用Total Exosome Isolation Reagent提取EVs；通过干涉光显微镜测量粒径，Western blot检测外泌体标志物CD9、CD81、Alix和TSG101。从EVs中提取RNA，利用QIAseq miRNA Library Kit构建小RNA文库，在Ion Torrent系统上进行100 bp单端测序，分析miRNA差异表达（差异倍数>2，FDR<0.01）。同时，培养原代小鼠海马神经元干细胞，分化14天后，分别用2.5×10⁸个对照或固定组EVs处理6小时，提取RNA，采用Ion AmpliSeq Transcriptome Mouse Gene Expression Kit构建mRNA文库，进行150 bp单端测序，分析差异表达mRNA（差异倍数>1.5，FDR<0.01），并使用DAVID工具进行GO和KEGG富集分析。

**研究结果**

**3.1 Body mass and tissue mass**
通过测量体重和肌肉质量，发现固定组与对照组小鼠体重无显著差异，但固定组比目鱼肌、跖肌、腓肠肌和股四头肌湿重均显著低于对照组（p<0.01），表明石膏固定成功诱导了后肢骨骼肌萎缩。

**3.2 Characteristics of extracellular vesicles isolated from the culture medium of mouse skeletal muscle**
对分离的EVs进行粒径分析，对照组平均粒径138.6±4.7 nm，固定组139.7±2.8 nm，两组间无显著差异；培养基中EVs数量也无显著差异。Western blot检测显示，两组EVs均表达外泌体标志物CD9、CD81、Alix和TSG101，证实所提取的EVs具有外泌体特征。

**3.3 Cast immobilization-induced miRNA expression changes in skeletal muscle-derived extracellular vesicles**
通过小RNA测序，以差异倍数>2且FDR<0.01为标准，鉴定出27个差异表达miRNA。与对照组相比，固定组中25个miRNA上调，2个下调。上调超过3倍的miRNA包括mmu-miR-3473b、mmu-miR-206-3p、mmu-miR-381-3p、mmu-miR-671-5p、mmu-miR-671-3p和mmu-miR-208b-3p。这些结果表明，肌肉萎缩促进了特定miRNA在EVs中的富集。

**3.4 mRNA expression changes in brain neuron cells following treatment with skeletal muscle-derived extracellular vesicles after cast immobilization**
对海马神经元进行mRNA测序，主成分分析显示对照EV处理组（CON EV）、固定组EV处理组（CI EV）和未处理组三者转录谱明显分离。以差异倍数>1.5且FDR<0.01为标准，CI EV处理组与CON EV处理组相比，共197个mRNA差异表达，其中47个上调，150个下调。GO分析显示，上调mRNA显著富集于程序性细胞死亡正调控（包括凋亡）等生物学过程。KEGG分析显示，p53、MAPK、FoxO及凋亡信号通路被激活。这些结果提示，萎缩骨骼肌来源EVs可诱导脑神经元中凋亡相关转录程序。

**讨论与结论**
讨论部分指出，固定萎缩肌肉来源EVs中miR-206、miR-146a、miR-125b等miRNA的表达升高，这些miRNA在阿尔茨海默病中已被报道参与神经元凋亡或认知功能调节。mRNA测序与通路分析进一步支持萎缩EVs可能通过激活p53和MAPK信号通路，促进神经元凋亡过程。值得注意的是，对照EVs处理神经元后，部分凋亡相关基因表达呈下降趋势，而萎缩EVs处理后则呈上升或不变，提示正常肌肉来源EVs可能维持神经元稳态，而萎缩EVs则改变了这一调节作用。然而，由于未处理组样本量较小，该观察需谨慎解释，并需进一步功能验证。

研究结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员发现，石膏固定诱导的肌肉萎缩改变了骨骼肌来源细胞外囊泡中的microRNA谱，以及暴露于这些囊泡的脑神经元中的mRNA谱。研究人员提供的证据表明，废用性肌肉萎缩诱导的骨骼肌来源细胞外囊泡性质的变化可能通过神经元凋亡在神经退行性疾病的发展中起重要作用。然而，萎缩诱导的骨骼肌来源细胞外囊泡的确切生物学功能仍不清楚。未来的研究有必要探讨在体内施用萎缩骨骼肌来源细胞外囊泡对小鼠认知功能的影响。