用于高效选择性检测N6-甲基腺苷的无标记电化学适配传感器：在人类尿液分析中的应用

《Talanta》：Label-Free Electrochemical Aptasensor for Sensitive and Selective Recognition of N6-Methyladenosine: Applicability in Human Urine

　　

摘要

在生物样本中精准检测极低浓度的N⁶-甲基腺苷（m⁶A）对于多种癌症和神经退行性疾病的临床诊断具有巨大潜力。本研究通过将硫醇修饰的适配体自组装到金电极表面，开发出一种低成本、无需标记的电化学适配体传感器。利用[Fe(CN)₆]^3-/^4-氧化还原探针，通过差分脉冲伏安法及电化学阻抗谱技术检测目标分子。该生物传感器在稀释的人造尿液样本中对m⁶A具有优异的选择性，能够有效区分结构相似的核苷以及内源性的电活性化合物。在最佳条件下，经6-巯基-1-己醇处理的电极通过差分脉冲伏安法可在3.2 pM至10 nM的范围内实现0.510 pM的检测限，而通过电化学阻抗谱则在同一范围内为0.700 pM。在1:25稀释的人造尿液样本中，该传感器通过差分脉冲伏安法的可回收率为95.70%，通过电化学阻抗谱则为96.20%，相应的相对标准偏差分别为2.65%和2.50%。这些结果证明了该适配体传感器在此类样本中的准确性和重复性均相当优异。因此，这种传感器有望作为一种无创诊断工具，提升患者在癌症及神经退行性疾病早期诊断、治疗和监测过程中的舒适度，为传统侵入性活检提供有力替代方案。

引言

核酸甲基化机制的异常变化在多种疾病中起着关键作用，包括癌症、帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病，以及各类自身免疫性疾病。在这些表观遗传修饰中，N⁶-甲基腺苷是真核生物mRNA中最常见的内部修饰，它参与调控RNA的稳定性、剪接、翻译、定位及降解过程。因此，m⁶A代谢紊乱已成为多种疾病早期诊断、预后判断及治疗效果监测的重要生物标志物。不过，生物样本中甲基化核苷的含量较低，且m⁶A与相关核苷的结构极为相似，这就需要具备高灵敏度和分子选择性的分析方法。

色谱法和质谱法，尤其是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，因能在复杂样本中实现高灵敏度且定量结果可靠，被广泛用于m⁶A的分析[1]、[2]。此外，还有多种基于分离技术的分析方法被开发出来，比如亲水相互作用液相色谱法、超高效液相色谱法、毛细管电泳法以及纳米流式LC–MS/MS技术，用以解决分析物含量低、样本复杂以及需要序列或位点特异性信息等问题[3]、[4]。尽管这些方法具有分析优势，但通常需要昂贵的仪器设备、专业操作人员、复杂的样品前处理流程以及专门的实验室设施，这限制了它们在快速、分散式检测中的应用[5]。

电化学生物传感器作为传统仪器分析方法的替代方案展现出巨大潜力，因为它们具备分析速度快、样品消耗少、操作简单、可微型化以及能与便携式仪器配合使用的优点。其分析选择性可通过抗体、DNA探针、DNA酶和适配体等分子识别元件来实现[6]。此外，功能化电极和纳米材料还能增加电极的电活性表面积并增强信号生成能力，从而有助于开发高灵敏度的即时检测平台[7]、[8]。然而，引入这些额外组件可能会增加制造步骤，进而影响电化学传感所具备的简洁性和重复性。

目前报道的用于检测m⁶A的电化学方法大多依赖于以抗体为基础的识别机制，同时还需要对电极进行大量修饰并采用信号放大策略。已有的检测平台包括经过多层石墨烯和金修饰的界面，结合Ag@SiO₂纳米颗粒以及磷标签-生物素化学技术[9]；经过金纳米粒子修饰的电极，搭配发夹形DNA探针和辣根过氧化物酶-IgG复合物[10]；基于His-PG/AuE界面的竞争型检测平台[11]；在丝印碳电极上通过生物催化方式沉积银离子的杂交链反应检测系统[12]；带有硫醇化核酸链和链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合结构的激光诱导石墨烯电极[13]；在一次性电极上应用磁性微载体辅助的检测方法[14]；以及通过电聚合β-环糊精或11-巯基十一烷酸/1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化蛋白A层来实现抗体定向固定的激光诱导石墨烯检测平台[15]、[16]。那些不依赖抗体的设计虽然减少了对抗体的依赖，但仍需要结构化的DNA框架以及电活性或酶学报告分子，比如结合四面体DNA纳米结构与甲苯蓝的m⁶A敏感型DNA酶[17]，或是带有生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶放大功能的TDN/AuNP复合结构[18]。尽管这类纳米材料、耦合剂、酶学标记物以及核酸放大元件能够提升信号强度，但它们也会增加制造复杂性、试剂消耗量、检测时间，还会提高对多种生物和化学试剂的依赖程度。

基于抗体的检测平台也存在诸多固有缺陷，比如生产成本高昂、批次间差异较大、稳定性较差，且在复杂样本中可能存在交叉反应问题。而适配体则提供了一种极具吸引力的替代方案——它们是通过指数富集法在体外通过系统的配体演化过程筛选得到的，可以以高纯度和高重复性进行化学合成，还可通过引入功能基团来用于传感器构建。适配体分子体积小、化学性质稳定，在适当条件下变性后仍能恢复其功能构象，同时还适用于微型化装置，因此基于适配体的生物传感器在分析和临床应用领域极具优势[19]。重要的是，目标分子引发的适配体构象变化可以通过电化学方法进行监测，无需对目标分子或识别元件进行标记，从而省去了电化学免疫传感器中常用的酶学标记物、二级抗体以及基于纳米材料的放大层。

据我们所知，目前还尚未有报道过用于检测m⁶A的电化学适配体传感器。在本研究中，我们开发出一种无需标记的生物传感策略，通过稳定的Au–S键将5′-硫醇修饰的适配体直接自组装到金电极表面，从而无需任何预处理即可实现对人造尿液中m⁶A的超灵敏检测。该传感器的检测原理基于适配体与m⁶A之间的特异性亲和力，这种亲和力会抑制[Fe(CN)₆]^3-/^4-氧化还原探针中的电子转移；电化学阻抗谱测量结果表明，该方法能够提高电荷转移电阻，同时降低差分脉冲伏安法检测到的峰电流值。与以往报道的多层电极检测平台不同，本研究所提出的平台仅以硫醇修饰的适配体作为唯一的生物识别元件，无需抗体、二级识别剂、酶学标记物、电活性标记物、纳米粒子复合材料或基于核酸的放大系统。

该平台还有一个显著优势，那就是巧妙地使用了6-巯基-1-己醇作为表面封阻剂，它能够在不充当额外识别或信号放大元件的情况下，将目标分子与电极的结合平衡时间从90分钟缩短至30分钟。因此，该平台提供了两种互补的检测模式：一种是无需MCH的检测模式，具备超痕量检测能力；另一种则是添加MCH的封阻界面，不仅平衡速度更快，而且电极表面结构更为有序。该平台能够区分m⁶A与结构相似的核苷及其他表观遗传修饰物质，还能耐受常见的尿液干扰物，并在人造尿液样本中实现良好的检测回收率。尤其值得关注的是，无需MCH的检测模式所能达到的检测限为阿托摩尔级，比以往报道的电化学研究结果低五个数量级[10]。该平台兼具简单的制作工艺以及高分析灵敏度和选择性，为其在m⁶A的无创检测领域中的应用奠定了良好基础。

章节节选

试剂与化学品

所有的寡核苷酸，包括经过5'硫醇（SH-）修饰的m⁶A特异性适配体（5'-SH- TTTAGTACTCATGCTCGATGGGGAATTACATTATTGTCGGA - 3'），均由土耳其安卡拉的Oligomer Biyoteknoloji Inc.公司合成。在制备和稀释适配体储备溶液时使用了无核酸酶的水，以此最大限度地减少核酸酶导致的降解。用于激活适配体上二硫键、使硫醇基团活化的试剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐，而用作表面封阻剂的则是6-巯基-1-己醇。

适配体筛选

筛选出针对m⁶A的适配体本身就极具挑战性，因为目标分子是一种小型核苷，仅在N6位置上与腺苷相比多了一个甲基取代基。正因如此，适配体的筛选需要通过反复的富集过程，同时还要对结构相似的核苷以及其他表观遗传修饰物质进行有效的负向筛选。因此，本研究中采用的通过SELEX技术获得的序列有望同时具备分子辨识功能以及……

结论

总之，本研究首次报道了一种用于检测m⁶A的电化学适配体传感器，这是一种无需标记且成本低廉的检测平台，其工作原理是基于通过Au-S共价键将硫醇末端修饰的适配体固定在金电极表面。金电极表面为适配体的结合提供了生物相容性良好且稳定的环境，而MCH修饰则通过调控适配体的空间取向，优化了该传感器在人造尿液中生理相关浓度范围内的检测性能。

CRediT作者贡献说明

Burcu DOGAN TOPAL：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿编写，研究指导，方法设计，数据整理，概念构思。 Veli Cengiz OZALP：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿编写，结果可视化，实验研究，数据整理。 Manolya Mujgan Y?ld?z：文章撰写——初稿编写，结果可视化，结果验证，方法设计，实验研究，数据整理

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

作者们要感谢安卡拉大学的科学研究项目组（项目编号：TSA-2023-2694）所提供的资金支持。Manolya Müjgan YILDIZ还要感谢TüB?TAK 2211-A国家博士奖学金计划的支持。本文是Manolya Müjgan YILDIZ博士研究工作的一部分。

Manolya Müjgan YILDIZ于2021年获得药剂师学位。她将于2026年7月从安卡拉大学毕业并获得博士学位，她的研究兴趣主要集中在药理活性化合物和生物标志物的电化学研究、电化学适配体传感器以及纳米传感器领域。自2024年起，她一直在洛克曼赫基姆大学药学院分析化学系担任研究助理。

Manolya Müjgan Y?ld?z|Veli Cengiz ?zalp|Burcu Do?an Topal

土耳其安卡拉大学健康科学研究生院