《Advanced Functional Materials》：Volatile Relay Biosensing and Mobile Phone Imaging for Detection of Influenza Virus
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用于诊断目的的挥发性有机化合物检测前景广阔，但设备依赖性强。在此，研究人员重新定义了挥发性物质在生物传感中的应用，并展示了使用手机摄像头对流感病毒进行即时检测。这一机会的关键在于，通过酶促放大将挥发性化学信号转化为易于成像的发光输出。为此，研究人员开发了一种非
用于诊断目的的挥发性有机化合物检测前景广阔，但设备依赖性强。在此，研究人员重新定义了挥发性物质在生物传感中的应用，并展示了使用手机摄像头对流感病毒进行即时检测。这一机会的关键在于，通过酶促放大将挥发性化学信号转化为易于成像的发光输出。为此，研究人员开发了一种非挥发性底物，该底物可被病毒转化为挥发性产物。该产物进入空气并离开测试溶液，重新进入相邻的检测体积，并在其中激活酶促报告级联反应。后者提供强大的信号放大和足够的光产生，以供手机摄像头检测。该检测方法的一大优势在于，物理分离测试和报告化学物质克服了混淆单体积检测的基质不相容性。利用这种方法，研究人员能够使用现成的实验室塑料器皿和手机摄像头区分流感病毒与其他呼吸道病毒。此外，该检测方法在检测患者样本中的流感病毒方面显示出潜力。
**研究背景与问题**
生物传感技术在医疗健康中广泛应用，但高精度检测通常依赖重型设备。即时检测方案（如侧流层析）虽便携，但受限于单体积检测中的化学不相容性。挥发性有机化合物（VOCs）作为诊断标志物潜力巨大，但现有分析依赖气相色谱/质谱（GC/MS）等昂贵设备，且存在样品基质干扰、难以定量等局限。电子鼻技术虽在发展中，但仍需复杂模式识别和标准化。为克服这些限制，研究人员开发了“挥发性中继生物传感”，旨在利用空间分离的测试与检测溶液，通过酶促放大空气中信号，实现无设备化的流感病毒检测。
**研究内容与结论**
研究人员设计并合成了一种非挥发性底物“硫原”（thiogen），该底物可被流感病毒神经氨酸酶（NA）特异性切割，释放挥发性硫醇（苯硫酚）。苯硫酚通过空气传播进入相邻检测液，激活“硫醇开关”机制——即通过二硫键保护的酶（如木瓜蛋白酶或肌酸激酶）的还原，恢复其催化活性，进而放大信号并产生荧光或发光。该技术成功检测了纯化NA、表达NA的病毒样颗粒（NA-VLPs）以及活流感病毒（A/PR/8/1934 H1N1），并能在复杂基质中区分流感与其他呼吸道病毒（如冠状病毒229E、鼻病毒16）。采用奥司他韦抑制实验验证了特异性，且优化后检测限低至1200 PFU（酶标仪）或3600 PFU（手机成像），接近标准MUNANA法（400 PFU），优于快速抗原检测（>3600 PFU）。在24例患者咽拭子样本中，该技术成功区分了流感阳性与阴性样本。
**重要意义**
该研究发表于《Advanced Functional Materials》。挥发性中继生物传感通过空间分离克服了化学不相容性，支持使用标准塑料器皿和手机摄像头进行即时检测，为资源有限环境下的病毒诊断提供了新范式，并可扩展至其他酶类检测。
**主要技术方法**
研究人员采用有机合成方法制备了6步反应的硫原底物（化合物7），通过高效液相色谱（HPLC）验证了NA介导的硫醇释放。利用荧光检测（木瓜蛋白酶PAP-z与荧光底物sq-CytC）和发光检测（肌酸激酶CK-z与萤火虫荧光素酶Luc）建立级联放大系统。在病毒样颗粒（VLP）检测中，使用了基于鼠白血病病毒（MLV）的假病毒系统，通过HEK293T细胞共转染MLVgagYFP与流感NA表达质粒制备。活流感病毒（A/PR/8/1934 H1N1）在MDCK细胞中扩增，其他呼吸道病毒（HCoV-229E、RV16）分别于Huh-7和H1-HeLa细胞中培养。患者样本来自乌尔姆大学医学中心病毒学诊断实验室的24例口咽/鼻咽拭子洗脱液，采用盲法qRT-PCR确诊。检测优化中使用384孔板手动切割连通相邻孔，并以密封膜隔绝外界。
**研究结果**
**2.1 设计并合成神经氨酸酶特异性底物**
研究人员以4,7,8,9-四-O-乙酰基-N-乙酰神经氨酸甲酯为起始原料，经6步合成获得硫原底物（化合物7），其结构包含唾液酸保护基、自消除对羟基苄醇连接臂和苯硫酚离去基团。HPLC分析显示，在产气荚膜梭菌神经氨酸酶（可切割α-2,3、α-2,6、α-2,8糖苷键）作用下，底物峰消失并出现与苯硫酚标准品保留时间一致的峰，证实酶介导的硫醇释放。
**2.2 基于荧光检测神经氨酸酶**
研究人员将二硫键保护的木瓜蛋白酶（PAP-z）及其荧光底物（sq-CytC）作为检测体系。单体积实验中，同时加入NA和硫原（TG）时荧光显著增强，而单独加入则无变化。在双体积挥发性中继模式中，将NA+TG置于测试孔，PAP-z体系置于相邻检测孔，共用顶空气体，结果检测孔荧光强度与单体积实验相当，首次验证了挥发性中继生物传感。进一步将检测体系封装于巨单层囊泡（GUVs）中，荧光显微镜和成像流式细胞术证实，未密封的GUVs在接触空气中的苯硫酚后激活催化，而密封组无信号。
**2.3 基于发光检测与手机成像**
研究人员将检测体系改为肌酸激酶（CK-z）和萤火虫荧光素酶（Luc）的偶联系统。单体积实验中，NA+TG共孵育导致短暂发光脉冲后衰减，提示化学不相容性。而挥发性中继模式中，检测孔发光持续增强，表明苯硫酚通过空气激活CK-z，产生稳定ATP供Luc使用。使用96孔板、离心过滤装置和蛋白结晶板均成功检测，发光信号可用商业成像仪和手机摄像头（iPhone 15 Pro Max）记录，检测限约10?? units/L NA。
**2.4 检测病毒样颗粒**
研究人员使用表达或不表达NA的MLVgag-VLP。在单体积荧光检测中，非纯化VLP（含细胞培养基）即使无底物也产生非特异性信号，而挥发性中继模式中，仅当NA阳性VLP与TG共存时，相邻检测孔才出现荧光，且纯化与非纯化VLP结果一致。发光检测同样显示，NA阳性VLP诱导强发光，手机成像可分辨。
**2.5 检测活流感病毒**
研究人员将活流感病毒（A/PR/8/1934 H1N1）与TG混合，测试孔中病毒浓度梯度（660,000至26,400 PFU/100 μL）与检测孔发光强度呈正相关，26,400 PFU时两独立重复阳性。加入奥司他韦（10 μM）完全抑制信号，而冠状病毒229E和鼻病毒16无信号，手机成像可清晰区分。
**2.6 优化灵敏度与基准测试**
研究人员使用384孔板手工切割配对孔，并优化检测液（含非挥发性还原剂巯基苯甲酸和表面活性剂）。酶标仪检测限低至1200 PFU，手机成像检测限为3600 PFU。与MUNANA法（400 PFU）和快速抗原检测（>3600 PFU）相比，挥发性中继生物传感在灵敏度上接近MUNANA，且兼具无设备化优势。
**2.7 患者样本检测**
研究人员对24例患者咽拭子洗脱液进行盲法检测，其中5例qRT-PCR确诊IAV阳性。挥发性中继生物传感中，IAV阳性样本的发光信号显著高于阴性样本（p<0.05），且与呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（AdV）等无交叉反应。
**讨论与结论**
讨论部分指出，挥发性中继生物传感克服了传统单体积检测中测试与报告体系化学不相容的局限，可在标准塑料器皿中工作，耐受复杂生物基质，并适用于有色或不透明样品。该平台基于条件活性分子设计：非挥发性底物被病毒NA转化为挥发性硫醇，二硫键保护的酶通过硫醇开关恢复活性。研究结论为：研究人员开发了挥发性中继生物传感，通过酶促放大空气中信号实现荧光/发光检测，从纯酶、VLP到活病毒和患者样本逐步验证，并证明手机摄像头可替代专用仪器。该技术可扩展至其他酶类检测，适合医疗、兽医、农业等领域的即时检测应用。
