CRISPR-Cas9技术可促进橙色壶菌中的同源基因敲入，而破坏DNA连接酶IV基因则能阻止转化现象的发生

《Scientific Reports》：Homologous knock-in processes facilitated by CRISPR-Cas9 in Aurantiochytrium and disrupting the gene for DNA ligase IV prevents transformation events

　　

摘要

本研究探讨了用于Aurantiochytrium limacinum的先进分子育种技术，这是一种真核微生物，因可用于工业生产DHA和虾青素而具有重要价值。我们首先利用CRISPR-Cas9系统同时破坏两个基因：crtIBY，这是一种作为视觉标记的多功能类胡萝卜素合成基因；以及lig4，它参与非同源末端连接反应。这种基因破坏使得野生型橙色菌落变成了白色菌落（Δlig4-ΔcrtIBY-TA#6），表明类胡萝卜素的生成已经停止。随后，我们通过使用单链寡脱氧核苷酸模板修复crtIBY基因，成功实现了标记物的重新利用，从而使菌落恢复橙色表型（Δlig4-TB#18）。进一步研究Δlig4菌株（TB#18）后发现，与野生型菌株相比，仅使用含有两个crtIBY同源区域的博来霉素抗性表达盒时，其整体转化效率显著下降。然而，当在电转过程中将博来霉素抗性表达盒与CRISPR-Cas9核糖核蛋白结合使用时，Δlig4菌株（TA#6和TB#18）通过双交叉事件实现的同源重组效率却高于野生型菌株。这些结果表明，虽然Lig4对于抵抗zeocin的转化过程很重要，但破坏NHEJ途径有助于实现更精确的基因定位。本研究证明了CRISPR-Cas9系统可作为研究A. limacinum功能基因组学和代谢工程的强大工具。