《Foods》：Regulatory Effects of Tannin Supplementation on Microbial Succession and Flavor Formation During Xiaoqu Light-Flavor Baijiu Fermentation
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高粱单宁被认为影响小曲清香型白酒（XLB）中的微生物生态和风味形成，但其具体贡献难以与由品种依赖性的大分子组分变化引起的混杂因素区分。为解决这一限制，研究人员建立了一个使用均匀低单宁底物的受控发酵系统。基于初步梯度试验，选择了1.0%的单宁添加水平，并结合高通
高粱单宁被认为影响小曲清香型白酒（XLB）中的微生物生态和风味形成，但其具体贡献难以与由品种依赖性的大分子组分变化引起的混杂因素区分。为解决这一限制，研究人员建立了一个使用均匀低单宁底物的受控发酵系统。基于初步梯度试验，选择了1.0%的单宁添加水平，并结合高通量测序和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）来研究单宁相关的微生物和挥发性变化。与未添加单宁的组相比，1.0%的单宁添加改变了发酵过程中细菌和真菌群落的演替，降低了Saccharomyces和Weissella的相对丰度，并富集了包括Cyberlindnera和Pantoea在内的分类群。单宁添加组表现出更复杂和稳定的微生物共现网络。此外，PICRUSt2预测表明，代谢潜力增强主要与碳水化合物和氨基酸途径相关。FUNGuild分析进一步表明，单宁添加改变了真菌营养模式组成，特别是腐生型和含腐生菌的类群。在发酵结束时，总挥发性化合物从4.208 μg/g增加到4.983 μg/g，总酯类和酸类分别增加了27.0%和112.3%，而总醇类减少了13.3%。Spearman相关性分析显示，单宁添加组中富集的非Saccharomyces真菌和产酸细菌与酸和酯的积累呈正相关，而对照组的微生物群主要与醇类特征相关。这些发现可能为XLB发酵过程中单宁相关的微生物和挥发性变化提供过程层面的证据。
小曲清香型白酒（Xiaoqu light-flavor Baijiu, XLB）以高粱为原料，其发酵过程受高粱中单宁（tannin）等成分影响。先前研究多通过比较不同高粱品种来探讨单宁的作用，但品种间大分子组分（如淀粉、蛋白质）的差异会混淆单宁的独立效应，难以明确其特异性贡献。为此，研究人员建立了受控发酵系统，通过添加外源单宁来排除其他成分的干扰，以精确评估单宁对微生物演替和风味形成的影响。研究人员选用均匀低单宁底物（澳大利亚红高粱，初始单宁含量0.2%），通过梯度试验确定1.0%单宁添加水平，并设置未添加组（TN0_0）和添加组（TN1_0）进行发酵。采用高通量测序（high-throughput sequencing）分析细菌（16S rRNA V3-V4区）和真菌（ITS1区）群落，结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）检测挥发性风味化合物，并利用PICRUSt2（基于16S rRNA基因预测细菌代谢功能的软件）和FUNGuild（真菌营养模式注释数据库）预测功能潜能。结果表明，1.0%单宁添加显著改变了微生物群落演替，降低了Saccharomyces和Weissella的相对丰度，富集了Cyberlindnera、Pantoea等分类群，并增强了微生物共现网络的复杂性。挥发性组分中，总酯和总酸分别增加27.0%和112.3%，总醇减少13.3%。Spearman相关性分析显示，富集的非Saccharomyces真菌和产酸细菌与酸酯积累正相关，而对照组微生物群主要与醇类相关。这些发现为单宁在XLB发酵中的调控作用提供了过程层面证据，有助于合理利用含单宁高粱进行生产。该论文发表在《Foods》期刊。
主要关键技术方法包括：①高通量扩增子测序：对细菌16S rRNA V3-V4区和真菌ITS1区进行扩增测序，经DADA2处理获得扩增子序列变异（ASV），并基于SILVA和UNITE数据库进行物种注释；②HS-SPME-GC-MS：采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术，对发酵醅（jiupei）中挥发性化合物进行半定量分析，并计算气味活性值（OAV）；③PICRUSt2：基于细菌16S rRNA基因ASV谱预测KEGG代谢通路功能；④FUNGuild：基于真菌ITS ASV谱注释真菌营养模式；⑤Spearman相关性分析：分析差异微生物与挥发性风味化合物的关联。样本来源：澳大利亚红高粱（Xike Agriculture Group），小曲（Huaxi Jiuqu Factory），单宁从宜宾糯红高粱中提取纯化（纯度>95%）。发酵在实验室进行，于0、3、6、10天取样。
**3.1 微生物群落的组成与差异**
**3.1.1 微生物多样性**：通过ACE和Chao1指数评估，TN1_0组细菌丰富度在大部分发酵时间点高于TN0_0，而真菌丰富度变化有限。Shannon和Simpson指数显示TN1_0组始终具有更高的α多样性。主坐标分析（PCoA）基于Bray-Curtis距离表明，两组细菌和真菌群落结构存在极显著差异（p<0.01），且单宁添加是主要驱动因素。
**3.1.2 微生物群落组成**：在属水平上，TN0_0组中Weissella逐渐成为优势细菌（第10天61.61%），而TN1_0组中Weissella未能主导，Pantoea和Enterobacteriaceae科未分类属丰度波动。真菌方面，TN0_0组始终以Saccharomyces为主，而TN1_0组呈现从Cyberlindnera向Clavispora和Cyberlindnera等非Saccharomyces酵母的演替，Saccharomyces相对丰度较低。
**3.1.3 差异丰度微生物**：线性判别分析效应大小（LEfSe）鉴定出TN0_0组特征性细菌为Lactobacillales和Weissella，真菌为Saccharomyces和Rhizopus；TN1_0组特征性细菌为Pantoea、Pseudomonas、Acetobacter等，真菌为Cyberlindnera、Clavispora、Meyerozyma、Neurospora。
**3.2 微生物群落中的相关性**：通过共现网络分析，TN1_0组网络节点数（1.56倍）和连接数（2.83倍）均高于TN0_0，平均度和平均聚类系数也更高，平均路径长度更短，表明TN1_0组微生物相关性网络更复杂、更稳定。关键节点（keystone nodes）分析显示，TN1_0组包含14个关键节点（含1个真菌节点），而TN0_0组为13个细菌节点，且两组无重叠，表明单宁添加改变了微生物的拓扑角色。
**3.3 醅中挥发性风味组成及其与微生物群落的关联**
**3.3.1 挥发性风味化合物比较**：发酵第10天，TN1_0组检测到30种化合物（总量4.983 μg/g），多于TN0_0组的25种（4.208 μg/g）。TN1_0组酯类（3.01 μg/g）和酸类显著高于TN0_0组（2.37 μg/g和0.46 μg/g），醇类（2.81 μg/g）低于TN0_0组（3.24 μg/g）。气味活性值（OAV）分析表明，壬酸、己酸乙酯和苯乙酸乙酯在两组中OAV>1，且TN1_0组壬酸显著增加。
**3.3.2 差异丰度微生物与风味化合物的关联**：Spearman相关性分析显示，TN0_0组的Saccharomyces、Rhizopus、Dialister和Weissella主要与醇类正相关，而与多种酯类负相关；TN1_0组的Cyberlindnera、Clavispora、Meyerozyma、Acetobacter、Pseudomonas等与酯类（如壬酸乙酯、己酸乙酯）和酸类（如乙酸、壬酸）呈显著正相关，与该组较高的酯酸含量一致。
**3.4 微生物群落的代谢功能潜力**：PICRUSt2预测结果表明，TN1_0组在碳水化合物运输与代谢、氨基酸运输与代谢、能量产生与转换、辅酶运输与代谢和脂质运输与代谢等功能的预测潜力显著高于TN0_0组，提示单宁添加可能增强了与风味前体形成相关的代谢能力。FUNGuild分析显示，TN1_0组真菌营养模式中腐生型和含腐生菌类群比例发生变化，与底物转化和风味前体释放相关。
讨论部分总结：上述结果证实了单宁添加通过选择特定微生物类群、改变群落互作网络和功能潜力，从而影响风味化合物谱。但功能预测和相关性分析不能直接证明因果关系，且挥发性化合物在醅中而非最终白酒中检测，其感官相关性需进一步验证。
结论：本研究表明，1.0%单宁添加与XLB发酵过程中微生物群落结构和风味谱的变化相关。单宁添加通常与细菌丰富度和多样性的增加、细菌和真菌群落的改变、Saccharomyces和
