使用肺液定量雾化器开发可控剂量气溶胶攻毒方法

《Microorganisms》：Development of a Controlled-Dose Aerosol Challenge Method Using a Lung Fluid Quantitative Nebulizer

　　

空气传播是流感病毒（influenza virus）传播的主要途径。在动物感染模型中，传统的鼻内滴注（intranasal instillation）无法重现自然呼吸道感染的生理特征。现有的气溶胶攻毒方法（包括全身吸入和口鼻暴露）在精确量化递送感染剂量方面存在局限性。此外，口鼻暴露系统需要专用且高成本的仪器。本研究建立了一种经济且剂量可控的气溶胶攻毒方法，利用肺液定量雾化器（lung fluid quantitative nebulizer），通过气管内插管将气溶胶化病毒直接递送至下呼吸道。雾化器产生的气溶胶的中值计数空气动力学直径（count median aerodynamic diameter, CMAD）为2.28 μm。研究人员比较了肺部递送气溶胶吸入与常规鼻内滴注PR8流感病毒（influenza virus）在小鼠中的肺部沉积效率和致病性。气溶胶吸入组的肺部沉积率为63.1%，半数致死剂量（LD₅₀）为31.1 EID₅₀；相比之下，鼻内滴注组的肺部沉积率为20.0%，LD₅₀为115.0 EID₅₀。组织病理学分析显示，通过肺部递送气溶胶吸入攻毒的小鼠肺部病变显著重于鼻内滴注组。此外，研究人员利用豚鼠模型和表达高斯荧光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）的重组PR8病毒（PR8-Gluc）证明，肺部气溶胶吸入导致病毒在肺组织中分布更均匀且病毒载量更高。研究结果表明，动物对肺部递送吸入病毒比鼻内滴注病毒更敏感。本研究为病毒感染模型提供了一种优化、经济且技术简单的气溶胶攻毒方法，具有可控的给药剂量。

**研究背景、问题与意义**
流感病毒（influenza virus）属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），是一种有包膜、单股负链RNA病毒。甲型流感病毒（IAV）抗原和遗传多样性最高，宿主范围最广，且通过气溶胶（aerosol）高效传播，具有抗原漂移（antigenic drift）和抗原转换（antigenic shift）能力，曾引发多次全球大流行，造成严重发病率和死亡率。因此，建立病因学相关的动物感染模型对研究病毒感染、致病机制和传播至关重要。目前，鼻内滴注（intranasal instillation）是实验室建立流感病毒感染模型最常用的方法，操作简单、剂量可控、变异小、重复性好，但缺乏生理真实性，无法模拟自然空气中的感染性飞沫或气溶胶吸入传播途径。研究表明，吸入病毒气溶胶是流感的主要自然传播途径之一，且与增强的感染性和致病性相关。现有的气溶胶攻毒方法包括全身吸入暴露和口鼻吸入暴露模型。全身吸入暴露存在多种局限性：需要大量攻毒材料；吸入剂量间接估算（依据监测点气溶胶浓度乘以分钟通气量和暴露时间），忽略室内浓度梯度、呼吸模式变异和行为调节；个体间生理和行为参数差异导致实际沉积剂量变异大，变异系数高；病毒气溶胶在皮毛表面沉降引入接触传播混杂因素。口鼻吸入暴露模型虽部分克服了全身吸入的剂量变异和传播途径模糊问题，但有效感染剂量仍需间接估算（通过生物气溶胶采样浓度乘以分钟通气量和暴露时间），涉及多个依赖步骤（气溶胶收集效率、病毒RNA回收、定量PCR灵敏度），引入系统偏差；此外，雾化液粘度、粒径分布、浓度、流速等也会影响呼吸沉积效率，因此难以精确量化动物实际吸入的有效感染剂量。口鼻吸入暴露系统还需要高精度设备、校准复杂、成本高、高剂量给药时间长，肺部递送效率低。肺部气溶胶递送（pulmonary aerosol delivery）已被广泛用于疫苗和治疗药物的靶向肺部给药，具有增强全身生物利用度和局部治疗作用的双重优势。肺泡表面积大、血-气屏障薄，有利于药物快速吸收进入体循环，避免胃肠道代谢和肝脏首过效应；肺部疫苗接种可引发病原体侵入部位的强效黏膜免疫。基于这些优势，研究人员假设将呼吸道病毒靶向递送至肺部可能建立更精确可控和可重复的动物感染模型，从而增强肺靶向疫苗和治疗药物抗病毒效果的临床前评估。本研究开发了一种经济且可精确量化的气溶胶感染方法，利用肺液定量雾化器（lung fluid quantitative nebulizer）进行气管内递送，并与传统鼻内滴注方法进行系统比较。研究首先评估了小鼠模型中PR8病毒的肺部沉积效率、半数致死剂量（LD₅₀）和肺部病理；随后利用重组PR8-Gluc病毒和豚鼠模型，比较了两种攻毒方法下病毒在肺组织中的空间分布均匀性和复制滴度。该研究描述了一种稳健且特征明确的病毒气溶胶感染方法，具有精确可控的给药剂量，代表了工程优化的肺部气溶胶递送方法，以弥补传统口鼻和全身气溶胶暴露系统的关键局限性。该论文发表在《Microorganisms》。

**主要关键技术方法**
本研究采用的主要关键方法包括：①使用肺液定量雾化器（Model HRH-MAG4）生成PR8病毒气溶胶，并通过空气动力学粒径谱仪（APS-3321）测量粒径分布（计数、表面积和质量中值空气动力学直径：CMAD、SMAD、MMAD）；②通过气管内插管（在专用小鼠喉镜和插管平台辅助下）将雾化器针头送至气管中部，并在吸气相触发雾化，实现肺部递送气溶胶吸入攻毒；③采用小鼠和豚鼠（均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司）模型，分别用50 μL和200 μL病毒悬液进行攻毒；④通过终点稀释法（EID₅₀）检测肺部病毒滴度以计算沉积效率；⑤利用概率单位分析（probit analysis）计算LD₅₀；⑥使用重组PR8-Gluc病毒（表达高斯荧光素酶）和体内生物发光成像系统（NightOWL II LB 983）进行肺部活体成像，分析病毒空间分布和复制动态。

**研究结果**
**3.1. 肺液定量雾化器产生的PR8气溶胶的空气动力学粒径**
通过空气动力学粒径谱仪（APS）测量，PR8气溶胶的计数、表面积和质量中值空气动力学直径（CMAD、SMAD、MMAD）分别为2.28 μm、4.11 μm和5.06 μm，几何标准差（GSD）分别为1.85、1.64和1.62。60.8%的颗粒数（count）和7.9%的颗粒质量（mass）空气动力学直径低于2.5 μm，93.9%的颗粒数和49.5%的质量低于5.0 μm。这提示气溶胶为多分散分布，细颗粒（≤2.5 μm）占数量主导，粗颗粒（>2.5 μm）占质量主导。

**3.2. 肺部递送气溶胶吸入的肺部沉积效率高于鼻内滴注**
以10⁴ EID₅₀ PR8病毒攻毒后15分钟内，肺部递送气溶胶吸入组的肺部病毒滴度显著高于鼻内滴注组，肺部沉积率为63.1%，约为鼻内滴注组（20.0%）的三倍，表明肺部递送气溶胶吸入显著增强了病毒在下呼吸道的沉积。

**3.3. 肺部气溶胶递送途径赋予小鼠病毒更强的致病性（与鼻内滴注相比）**
通过10倍系列稀释病毒（10¹–10⁴ EID₅₀）攻毒，监测体重和生存率显示剂量-反应关系。肺部气溶胶吸入组在10⁴、10³、10²、10¹ EID₅₀剂量下的致死率分别为100%、100%、80%和20%，平均死亡时间4天；鼻内滴注组相应致死率为100%、100%、40%和0%，平均死亡时间4.6天。概率单位分析得出肺部气溶胶吸入组的LD₅₀为31.1 EID₅₀（95%置信区间1.4–263.8），鼻内滴注组LD₅₀为115.0 EID₅₀（但无法计算可靠置信区间）。在病毒复制滴度方面，以10⁴ EID₅₀攻毒后，肺部气溶胶吸入组在1 dpi和3 dpi的肺部病毒滴度分别比鼻内滴注组高0.4和0.65 log₁₀ EID₅₀（3 dpi差异显著，p<0.05）。肺指数（lung index）在两组间无统计学差异，但气溶胶组均值略高（1 dpi高7%，3 dpi高9%），提示可能引起更明显的肺水肿。组织病理学显示，气溶胶攻毒组支气管腔内有大量坏死细胞碎片，肺泡壁增厚并伴有大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，血管周围炎性套；鼻内滴注组仅见局灶性上皮细胞脱落和少量嗜酸性黏液分泌。半定量评分显示气溶胶组平均病理学评分为3.60±0.55，显著高于鼻内滴注组的2.80±0.45（p<0.05），表明肺部气溶胶感染诱导更严重的肺组织损伤。

**3.4. 通过肺部气溶胶递送的病毒在豚鼠肺组织中呈现更均匀的空间分布和更高的病毒滴度**
利用PR8-Gluc病毒和生物发光成像，在0、12、24、48、72小时对豚鼠肺部进行成像。结果显示，肺部气溶胶吸入递送的PR8-Gluc在肺组织中分布更均匀。生物发光信号强度和EID₅₀病毒滴度在24、48、72小时均显著高于鼻内滴注组（p<0.05或p<0.01），表明肺部气溶胶吸入导致下呼吸道感染更高效。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究利用肺液定量雾化器通过气管内插管将病毒气溶胶直接递送至下呼吸道，避开了鼻部过滤屏障，使多分散气溶胶全部进入下呼吸道，从而获得高肺部沉积率（63.1%），显著优于传统全身吸入模型（0.14%）和口鼻暴露模型（1.3%–30%）。该方法具有给药剂量可控、操作经济、快速、可重复性好等优点，但绕过了上呼吸道，不模拟自然感染的全过程，适用于聚焦肺部感染动力学、肺组织发病机制和肺靶向干预效果的研究。气溶胶粒径分布中，细颗粒（≤2.5 μm）通过重力沉降和布朗扩散沉积于远端细支气管和肺泡，粗颗粒（>2.5 μm）通过惯性撞击沉积于气管支气管树，导致广泛感染。研究还讨论了三个局限性：①未测定雾化器/管路中残留病毒和鼻、气管、胃等肺外组织病毒载量，未充分验证绝对肺剂量；②LD₅₀分析的样本量较小，导致置信区间宽，鼻内组无法计算稳定置信区间，LD₅₀值应视为趋势估计；③气管内插管需要操作者进行系统培训（约2周），但比专用全身/口鼻暴露系统更经济、操作更简便、剂量更准确。

**结论翻译**：
本研究建立了一种经济且剂量可控的气溶胶感染方法，其肺部沉积效率显著高于鼻内滴注。因此，该气溶胶方法在小鼠中诱导更强的致病性——表现为LD₅₀值降低的趋势、肺组织病毒滴度升高以及更明显的组织病理学肺病变。此外，该方法在豚鼠肺组织中实现了显著更均匀的感染空间分布。总之，这种特征明确的气溶胶感染模型构成了一个稳健且剂量可控的临床前平台，用于开发与评估肺靶向疫苗和治疗药物。