《Applied and Environmental Microbiology》：Constitutive, endogenous, fluorescent membrane reporters for dynamic cell cycle analysis in Bacillus subtilis
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细菌增加生物量并进行分裂，但精确确定细胞分裂完成的时间在技术上具有挑战性。为了帮助延时成像和细胞周期追踪，研究人员着手在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中鉴定一种蛋白质，当与荧光团融合时，该蛋白质会使膜以组成型、均匀和明亮的方式发出荧光。使用
细菌增加生物量并进行分裂，但精确确定细胞分裂完成的时间在技术上具有挑战性。为了帮助延时成像和细胞周期追踪，研究人员着手在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中鉴定一种蛋白质，当与荧光团融合时，该蛋白质会使膜以组成型、均匀和明亮的方式发出荧光。使用基于正向遗传转座子的方法，结合荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS），研究人员鉴定出与葡萄糖PTS跨膜转运蛋白PtsG的荧光融合物，该融合物具有所有期望的特性。此外，PtsGΩmsfGFP（单体超折叠绿色荧光蛋白融合到PtsG）在所有测试条件下都是组成型表达且对生长中性，并在孢子形成期间也标记膜。研究人员使用PtsGΩmsfGFP在微流控通道中追踪细胞生长，并修改了细胞分裂（cytokinesis）的定义，即当膜荧光在分裂平面达到局部最大值时，该定义进一步被光漂白后荧光损失（fluorescence loss in photobleaching, FLIP）显微镜支持。与细胞分裂蛋白FtsZ的兼容荧光融合物同时成像表明，FtsZ峰值强度出现在隔膜收缩中途，并且Z环回收与细胞分裂同时发生。研究人员得出结论，PtsGΩmsfGFP是膜成像和细胞周期追踪的有用工具。因此，研究人员提供了具有发射可见光谱荧光团和各种抗生素抗性盒的构建体，以促进在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）中的应用。重要性：细菌细胞在新生膜分离每个子细胞质时完成分裂。使用外源性标记对细菌膜进行可重复染色用于荧光显微镜可能具有挑战性，特别是在微流控装置中的恒化生长期间。研究人员报告，将荧光蛋白与葡萄糖转运蛋白PtsG融合，可使枯草芽孢杆菌的膜在各种条件下发出明亮、均匀的荧光。研究人员使用PtsGΩmsfGFP改进了微流控生长过程中细胞分裂的定义，并注意到荧光PtsG融合物可能有助于任何生物体中的荧光膜染色，至少在理论上是如此。
**论文解读**
**研究背景与动机**
细菌细胞分裂的精确测定是微生物学研究的核心难题。传统方法如分光光度法（通过光密度测量生物量增加）和活菌计数（需延时培养形成菌落）均无法直接、实时地追踪单个细胞的分裂事件。微流控技术与荧光显微镜结合可实现单细胞水平的动态观察，但确定细胞分裂（cytokinesis）完成的精确时刻仍具挑战性，尤其是在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中，隔膜形成后细胞分离可能延迟，导致难以通过相差显微镜直接判断。外源性膜染料（如FM4-64、TMA-DPH）在长时间恒化培养中难以均匀分布，且可能引入膜扰动。因此，研究人员旨在开发一种内源性、组成型表达的膜荧光报告系统，以实现对细胞周期的高分辨率动态分析。
**研究内容与结论**
研究人员通过正向遗传筛选，鉴定出葡萄糖PTS跨膜转运蛋白PtsG与单体超折叠绿色荧光蛋白（msfGFP）的融合体（PtsGΩmsfGFP），该融合体在多种条件下（丰富培养基、限制性培养基、孢子形成期）均能产生明亮、均匀且组成型的膜荧光，且不影响细胞生长。利用此报告系统，研究人员在微流控装置中追踪细胞生长，重新定义了细胞分裂的判定标准——当隔膜处的膜荧光强度达到局部最大值时，即标志着细胞分裂完成。该定义通过光漂白后荧光损失（FLIP）实验验证，并发现与胞质荧光下降40%的标准一致。同时，结合mCherry-FtsZ（细胞分裂蛋白FtsZ的荧光融合体）成像，揭示了FtsZ在隔膜收缩中期达到峰值强度，随后迅速解聚，与细胞分裂完成同步。此外，研究人员构建了多种荧光蛋白（CFP、msfGFP、mVenus、mLychee）和抗生素抗性（壮观霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素）组合的PtsG融合体，便于在枯草芽孢杆菌中广泛部署。该研究提供了用于膜成像和细胞周期追踪的稳健工具，论文发表在《Applied and Environmental Microbiology》。
**关键技术方法**
主要关键技术方法包括：①基于转座子TnFLXmsfgfp的正向遗传诱变，随机生成蛋白质-msfGFP融合文库；②荧光激活细胞分选（FACS）筛选高荧光细胞个体；③荧光显微镜筛选细胞定位模式（膜、胞质、点状等）；④微流控装置中的时间延迟成像及荧光强度分析；⑤光漂白后荧光损失（FLIP）显微镜验证细胞质分离状态。样本来源：枯草芽孢杆菌野生型菌株DK1042（祖先背景）和实验室菌株PY79。
**研究结果**
1. **A forward genetic approach to isolate msfGFP fusions with membrane localization**：通过转座子诱变和FACS，从约4×10
7个细胞中分选出约2000个荧光个体，经荧光显微镜筛选，鉴定出12个独特插入位点。其中，PtsG的两个插入位点（PtsG
early和PtsG
late）产生膜定位荧光，且PtsG
earlyΩmsfGFP荧光更亮，被选为后续研究对象。
2. **PtsGΩmsfGFP does not appear to confer a growth defect**：在LB、CH、S750（加1%葡萄糖或甘油）等多种培养基中，PtsGΩmsfGFP表达菌株与野生型生长曲线一致，无显著差异。在微流控装置中，细胞分裂时间（58±18 min vs 61±12 min）和平均细胞长度（4.3±0.9 μm vs 4.2±0.9 μm）也无统计学差异，表明该融合蛋白对生长无负面影响。
3. **Endogenous membrane labeling improves time resolution of cell division**：在微流控中同时观察PtsGΩmsfGFP和胞质mCherry，发现膜荧光在分裂位点逐渐增加至最大值，而胞质荧光下降20%的定义（先前方法）早于隔膜形成约1/4细胞周期。提出以膜荧光局部最大值作为细胞分裂的新定义，具有更宽动态范围。
4. **Bleach ratio by FLIP imaging indicates when cytoplasms become separate**：对100个细胞进行FLIP实验，分析漂白后胞质信号标准差。结果显示，当胞质荧光在细胞中部降至细胞极的40%时，细胞质发生分离；而膜荧光在细胞中部达到100%时，细胞质分离。因此，细胞分裂的准确定义应为膜荧光最大值，或胞质荧光下降40%。同时，mCherry-FtsZ成像表明，FtsZ在膜内陷开始前积累，在膜荧光达到约50%最大值时FtsZ强度达到峰值，随后快速解聚，在膜横切时基本消失，表明FtsZ回收与细胞分裂同时发生。
**讨论与结论**
讨论部分总结，PtsGΩmsfGFP作为内源性膜标记，避免了外源染料的局限性，组成型表达且不影响生长，适用于多种遗传背景和实验条件。通过新定义，提高了细胞分裂时间分辨率，并修正了先前胞质荧光下降20%的定义（应改为40%）。FtsZ动力学分析表明，FtsZ在隔膜收缩中期达到峰值，并在分裂完成时快速解聚，而非先前认为的持续存在于细胞极。研究人员提供了多种荧光和抗性组合的构建体，便于用户使用。研究结论翻译：研究人员得出结论，PtsGΩmsfGFP是一种用于膜荧光标记的稳健工具，可根据需要修改以满足用户需求。
