家禽处理相关应激改变空肠弯曲杆菌Bf的膜组成、细胞外囊泡产生、存活和毒力

《Applied and Environmental Microbiology》：Poultry handling-related stress alters membrane composition, extracellular vesicle production, survival, and virulence in Campylobacter jejuni Bf

　　

研究人员研究了耐氧空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）Bf菌株对模拟家禽屠宰过程条件的适应性。结果表明，C. jejuni Bf在联合热应激与氧化应激下能够存活并主动增殖。应激暴露诱导细胞变圆、运动性丧失、膜组成重塑、膜流动性降低，以及代谢重编程，细胞内ATP水平升高。在维持其质膜脂质组成的同时，C. jejuni在应激暴露下调节其细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的脂质组成。值得注意的是，应激的C. jejuni细胞释放的细胞外囊泡对Caco-2细胞上皮屏障的毒性增强，可能促进肠道上皮的侵袭。

论文解读：家禽加工相关应激对空肠弯曲杆菌Bf的适应性策略与毒力影响

细菌感染仍然是全球医学和公共卫生面临的重大挑战。空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）感染是全球食源性胃肠炎的主要原因之一，家禽是主要传染源。流行病学估计，50%至80%的人弯曲杆菌病病例来源于家禽储库。然而，C. jejuni在实验室条件下生长要求苛刻，却能在看似不利的环境中广泛存在，这一现象构成悖论。在禽肉加工过程中，C. jejuni会遭遇热、冷、酸和氧化等多种应激。急性应激可使螺旋状细胞转变为球菌样形态，并进入活的但不可培养（viable but non-culturable, VBNC）状态，导致常规检测困难。已有研究表明，临床分离的C. jejuni多数具有高耐氧性，但耐氧与毒力之间的机制联系尚不清楚。因此，理解耐氧菌株在模拟家禽加工应激下的适应机制，对控制人类感染具有重要意义。

研究人员以耐氧的空肠弯曲杆菌Bf菌株为对象，模拟家禽屠宰过程中的连续应激——50°C热水浴5分钟、?20°C冷冻4分钟，随后在4°C开放氧气环境下培养。研究发现，Bf菌株在联合热氧应激下并未进入休眠，而是继续存活并缓慢增殖，细胞内ATP水平显著升高。应激诱导细胞从螺旋形向球菌样转变，运动性丧失，细胞表面电荷降低，膜通透性增加。同时，细菌释放的细胞外囊泡（bEVs）在数量不变的情况下，尺寸和干质量增大，且携带DNA的比例增加。脂质组学分析显示，应激后细菌质膜的脂质组成基本不变，但bEVs的脂质组成发生显著变化，例如PG类脂质中奇数碳饱和脂肪酸富集，环丙烷脂肪酸减少。脂肪酸分析表明，应激细胞膜中不饱和脂肪酸C17:1比例上升，但膜流动性反而下降。蛋白质组学发现，应激上调了能量代谢相关蛋白，并改变bEVs的蛋白货物，使其携带更多毒力因子。最后，细胞实验显示，应激细菌释放的bEVs对Caco-2细胞上皮屏障的破坏作用增强。该成果发表在《Applied and Environmental Microbiology》。

该研究采用了多项关键技术方法。以空肠弯曲杆菌Bf菌株为研究对象，通过平板计数、ATP测定、Zeta电位和EtBr渗透实验评估存活与细胞膜性质；利用超速离心结合碘克沙醇密度梯度离心纯化bEVs，并用透射电镜、动态光散射、纳米流式细胞术和定量相位成像表征其形态、尺寸和干质量；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行脂质组学和蛋白质组学分析，气相色谱测定脂肪酸组成；使用Caco-2人肠上皮细胞模型，通过MTT和跨上皮电阻（TEER）检测细胞毒性和屏障完整性。

研究结果分为以下几个部分：

**联合热氧应激下C. jejuni Bf的存活。** 通过相衬显微镜和电镜观察，应激后细菌由螺旋形变为球菌样，细胞长度减小、宽度增加。在联合应激后，细菌数量仅轻微下降，随后恢复增长。ATP水平在应激后显著高于未应激细胞，表明细胞代谢活跃而非休眠。Zeta电位测量显示应激细胞表面负电荷减少，EtBr渗透实验显示细胞膜通透性增加。

**应激改变C. jejuni Bf释放bEVs的特征。** 通过密度梯度离心纯化bEVs，DLS和纳米流式检测发现应激细菌释放更大的囊泡（平均水动力半径从约198 nm增至约487 nm），干质量从约6063 MDa增至7141 MDa。NTA显示囊泡产量无显著差异。DNA染色分析表明，应激来源的bEVs中内部DNA阳性比例（48.1%）和内外DNA双阳性比例（25.9%）均高于对照（41.8%和6.7%）。

**应激条件下C. jejuni产生具有独特脂质特征的bEVs。** 质谱脂质组学在细菌细胞和bEVs中鉴定出43种脂质，属于磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）。在细菌细胞中，应激与对照间的脂质组成无显著差异；但bEVs中，应激样本的PG(31:0)和PG(32:0)分别上调5倍和4.7倍，而含C19:1的PG种类显著减少，LPE(16:0)和LPE(18:1)分别下调4.7倍和4.9倍。此外，bEVs膜与细菌质膜的PG组成明显不同，bEVs富集了含奇数碳饱和脂肪酸（C15:0、C17:0）的PG。

**联合应激驱动C. jejuni中不饱和脂肪酸积累和bEVs中环丙烷脂肪酸耗竭。** 气相色谱分析表明，应激细胞中C17:1比例从0.68%升至2.76%，总不饱和脂肪酸含量增加。但Laurdan GP测定显示应激细胞膜流动性反而降低。bEVs的脂肪酸谱与亲本细胞不同，并且应激后bEVs中C17:0和C19环丙烷脂肪酸的相对丰度显著降低。

**应激影响C. jejuni细胞及其bEVs的蛋白质含量。** 蛋白质组学共鉴定出非应激细胞660个蛋白，应激细胞424个蛋白，其中421个共有。应激细胞中上调蛋白包括甲酸脱氢酶、硝酸还原酶等能量代谢相关蛋白，下调蛋白包括cbb3型细胞色素C和延胡索酸还原酶。bEVs蛋白组中，70%为共有蛋白，应激特异蛋白包括铁ABC转运体、荚膜多糖输出系统蛋白、鞭毛钩相关蛋白、BamA和Hcp等毒力因子。

**应激增强C. jejuni细胞和bEVs对Caco-2细胞的细胞毒性。** MTT实验显示，非应激和应激来源的bEVs均能杀死约38%和40%的Caco-2细胞，二者差异不显著。TEER实验表明，应激来源的bEVs处理后，Caco-2单层TEER值从141 Ω/cm²降至127 Ω/cm²，而对照bEVs处理组TEER值略有上升，说明应激bEVs更有效地破坏上皮紧密连接。

讨论部分指出，耐氧C. jejuni通过膜组成重塑和形态转变来应对连续应激，而非进入休眠。bEVs的脂质和蛋白质货物具有选择性，表明其释放是程序化过程而非细胞裂解产物。应激条件下bEVs携带的鞭毛钩相关蛋白、BamA等侵袭因子可能促进细菌穿透肠上皮。研究结论为：耐氧弯曲杆菌可能采用一种“膜适应性策略”，在快速克服应激条件的同时增强其毒力。这为理解C. jejuni在食物链中的持久性和致病性提供了新视角，有助于制定更有效的食品安全控制措施。