《Applied Food Research》：Preparation of Coregonus peled Protamine Peptides and Construction, Characterization, and In Vitro Delivery Efficacy Evaluation as Oral Insulin Delivery Carriers
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本研究以高白鲑（Coregonus peled）加工副产物精巢为原料，通过超声波辅助提取（ultrasonic-assisted extraction）获得鲑鱼精蛋白（salmon protamine），再经酶解制备。采用单因素实验结合响应面法（respons
本研究以高白鲑（Coregonus peled）加工副产物精巢为原料，通过超声波辅助提取（ultrasonic-assisted extraction）获得鲑鱼精蛋白（salmon protamine），再经酶解制备。采用单因素实验结合响应面法（response surface methodology, RSM）优化酶解工艺，在最优条件下蛋白质水解度（degree of hydrolysis, DH）达到33.94%。质谱鉴定（mass spectrometry）共获得2199个肽段，其中含有9-15个氨基酸残基（amino acid residues, AARs）的肽段为主要组分。利用鲑鱼精蛋白肽（protamine peptides, PMP）的跨膜特性，构建了胰岛素-鱼精蛋白肽复合物（Ins-PMP）。紫外（ultraviolet, UV）全波长扫描显示，胰岛素与PMP形成稳定的复合物，具有特征光谱响应，其中2000-3000 Da的肽段对复合物形成贡献最大。傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）分析表明，与单独胰岛素相比，复合物结构稳定性显著增强，并发生明显重构。采用Caco-2细胞模型进行体外评价。MTT实验显示，在0-200 μg/mL浓度范围内，PMP对Caco-2细胞无明显毒性（P>0.05）。体外细胞摄取和转运实验表明，1:4（w:w）复合物使Caco-2细胞胰岛素摄取效率和转运效率分别提高21.64%和73.18%。此外，跨上皮细胞电阻（trans-epithelial electrical resistance, TEER）测试证实其具有优异的生物相容性。本研究系统阐明了以高白鲑加工副产物精巢为来源的PMP的制备方法及其作为胰岛素递送载体的潜力，为水产加工副产物的高值化利用及口服肽递送系统开发提供了理论依据。
**论文解读：高白鲑鱼精蛋白肽作为口服胰岛素递送载体的制备、表征与体外评价**
**研究背景与问题**
糖尿病是一种全球性慢性代谢疾病，胰岛素是唯一能降低血糖的激素，临床治疗主要依赖皮下注射，但此方式存在侵入性、患者依从性差及并发症风险高等问题。口服给药符合生理机制且无创，是理想给药途径。然而，胰岛素作为一种大分子亲水性蛋白，在胃肠道易被酸、碱和蛋白酶降解，且膜通透性极低，导致口服生物利用度极低。现有口服递送载体（如纳米颗粒、微胶囊）虽能改善胃肠稳定性，但无法从根本上解决跨膜转运效率低的核心问题。因此，开发能同时保护胰岛素并高效促进其跨肠上皮转运的新型载体具有重要意义。
鱼精蛋白（protamine）是一种富含精氨酸（arginine）的碱性蛋白，天然存在于鲑科鱼类精巢中，具有广谱抗菌活性。但天然鱼精蛋白分子量较大（4-6 kDa），带强正电荷，易引起非特异性炎症和过敏反应，且极性大，难以穿透生物膜屏障。酶解制备的鱼精蛋白肽（protamine peptides, PMP）不仅克服了母体蛋白的局限性，还保留了细胞穿透肽（cell-penetrating peptides, CPPs）特性，具备抗氧化、抗炎等生物活性。与传统载体（如壳聚糖、TAT肽、低分子量鱼精蛋白）相比，PMP具有温和酶解制备、来源天然、兼具跨膜活性和多重生物活性的独特优势。高白鲑（Coregonus peled）是新疆特有冷水鱼，其加工副产物精巢富含鱼精蛋白，但目前尚未被高值化利用。
本研究旨在回答以下核心问题：能否从高白鲑加工副产物精巢中提取制备PMP，并利用其富含精氨酸的阳离子序列与胰岛素通过静电相互作用形成结构稳定的复合物？该复合物能否通过PMP介导的跨细胞转运机制，在维持肠上皮屏障完整性的同时，显著提高胰岛素细胞摄取和跨膜转运效率？基于此，研究人员构建了胰岛素-鱼精蛋白肽复合物（Ins-PMP），并在Caco-2细胞模型中系统评价其细胞毒性、摄取效率和跨膜转运能力，为口服胰岛素递送克服技术瓶颈提供可行途径，同时为水产加工副产物高值化利用和肽类药物口服递送载体设计提供理论指导。该论文发表在《Applied Food Research》。
**主要关键技术方法**
本研究采用超声波辅助提取法从高白鲑（Coregonus peled）加工副产物精巢中提取鲑鱼精蛋白，经胰蛋白酶（trypsin）酶解后，通过单因素实验和响应面法（response surface methodology, RSM）优化酶解工艺，获得分子量范围为1000-5000 Da的PMP。利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行肽段鉴定。构建Ins-PMP复合物时，将PMP与胰岛素按不同质量比混合，并通过透析纯化。采用紫外（UV）全波长扫描、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）表征复合物结构。体外评价基于Caco-2细胞单层模型（来源于人结直肠腺癌细胞系），通过MTT法检测细胞毒性，荧光标记法评估细胞摄取效率，以及胰岛素ELISA试剂盒测定跨膜转运效率，同时监测跨上皮细胞电阻（TEER）以评估屏障完整性。
**研究结果**
**3.1 酶解工艺优化与水解度测定**
通过单因素实验筛选出最优酶解条件：胰蛋白酶、pH 8.3、酶浓度3.2%、液料比175:1、温度40°C、水解时间1.5 h。在此基础上，采用响应面法优化，确定最优工艺为水解时间1.5 h、液料比125:1、酶用量6.4%，模型预测水解度32.26%。经三次平行验证，实际平均水解度为33.94%，与预测值接近，表明模型具有良好预测能力。根据氨基酸组成计算总肽键数（h
tot）为7.42 mmol/g，为水解度计算提供基础。
**3.2 PMP的鉴定与分析**
LC-MS/MS鉴定共获得2199个独特肽段，长度范围为8-35个氨基酸残基（amino acid residues, AARs），其中以9-15 AARs肽段比例最高。这种分布模式源于胰蛋白酶的非特异性水解，包括在精氨酸和赖氨酸位点的优先切割以及因底物构象等因素导致的漏切和非特异性切割，从而产生多样化肽段。此外，鱼精蛋白的多亚型特性及翻译后修饰（如氧化、乙酰化）进一步增加了肽段多样性。
**3.3 Ins-PMP结合分析**
UV全波长扫描显示，Ins-PMP复合物在286 nm处吸光度显著高于胰岛素单体，表明形成稳定复合物并引起色氨酸残基微环境变化。而天然鲑鱼精蛋白或标准品与胰岛素混合后未产生明显吸光度变化，说明其无法形成稳定复合物。分子量筛选实验表明，2000-3000 Da肽段对复合物形成贡献最大，该分子量段兼具适中正电荷密度和构象灵活性，能有效结合胰岛素。而更低或更高分子量肽段因电荷不足或空间位阻较大，结合能力较弱。
**3.4 Ins-PMP结构分析**
FTIR光谱显示，随着PMP比例增加，复合物酰胺A带（N-H伸缩振动）从3313 cm
-1移至3386 cm
-1，表明氢键环境改变。酰胺I带（1700-1600 cm
-1）分析揭示复合物二级结构发生显著重排：α-螺旋含量持续下降，β-折叠含量逐渐增加，呈现剂量依赖性。在1:4和1:8比例时，复合物二级结构以α-螺旋和β-折叠为主导，比例显著高于低PMP比例组。
**3.5 Ins-PMP微观形貌分析**
SEM观察显示，PMP呈块状结构，胰岛素呈卷曲片状。不同比例Ins-PMP复合物形态发生重构：低比例（1:0.1）呈不规则片层；中比例（1:0.5、1:1、1:2）逐渐转变为球状；1:4比例时形成均匀球形结构，表面光滑，粒径分布窄；1:8比例时出现明显聚集，形态不规则，与FTIR中β-折叠进一步增加的趋势一致，表明高PMP比例可能诱导表面性质改变导致聚集。
**3.6 Caco-2细胞模型建立与表征**
Caco-2细胞在培养21天内呈现典型阶段性生长分化：第1-12天快速增殖融合成单层，第15天进入分化中期，形成极性排列的微绒毛结构。跨上皮细胞电阻（TEER）在第21天稳定在330.67±1.68 Ω·cm2，大于300 Ω·cm2，满足转运实验要求。碱性磷酸酶（ALP）活性检测显示，AP侧活性始终显著高于BL侧，证实细胞极性建立和屏障完整性。
**3.7 Ins-PMP细胞毒性**
MTT实验表明，在0-200 μg/mL浓度范围内，PMP处理Caco-2细胞4 h和8 h均未显著影响细胞活力（P>0.05）。不同比例Ins-PMP处理后，细胞形态未见破裂、变形或生长抑制。该低毒性可能源于PMP自身低细胞毒性、Caco-2细胞固有防御机制及有限的细胞内分布，确认PMP在肠上皮细胞模型中具有良好的安全性。
**3.8 Ins-PMP细胞摄取**
荧光显微镜观察显示，在Ins:PMP=1:2和1:4比例时，细胞内荧光强度显著高于胰岛素单独组，且分布更均匀。荧光分光光度法定量结果表明，在1:2和1:4比例时，摄取效率分别提高2.27%和21.64%；而低比例（1:0.1、1:0.5、1:1）和高比例（1:8）时摄取效率降低。低比例时正电荷不足，复合物带负电与细胞膜排斥；高比例时过量正电荷导致非特异性交联聚集，阻碍摄取。1:4比例达到电荷平衡和跨膜活性的最佳平衡，显著促进胰岛素摄取。
**3.9 Ins-PMP细胞转运**
在0.5 h转运初期，各实验组累积转运量无显著差异；随时间延长，Ins:PMP=1:4组转运优势逐渐显现，转运效率比胰岛素单独组高73.18%。TEER监测显示，1.5 h转运后各组TEER比值接近1，且处理前后无显著差异（P>0.05），表明复合物未破坏Caco-2单层完整性，屏障功能稳定。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究存在一定局限性：尚未确定复合物在细胞膜脂筏和关键膜蛋白上的精确结合位点；缺乏动态TEER时间曲线以证实复合物是否通过可逆调节紧密连接促进转运；内吞后溶酶体逃逸效率及胞内转运分子机制有待深入；基于Caco-2单层模型的体外结果需在动物模型中进一步验证口服递送效果和体内安全性。未来将结合动态TEER监测、通路抑制剂干预、荧光共定位追踪和分子动力学模拟完善完整跨膜调控网络。
研究结论部分翻译如下：本研究从新疆冷水鱼高白鲑（Coregonus peled）加工副产物精巢中提取鲑鱼精蛋白，并通过响应面法优化酶解工艺，制备得到以9-15肽段为主要组分的PMP。在最优酶解条件（水解时间1.5 h、液料比125:1、酶用量6.4%）下，水解度达到33.94%。在此基础上，利用PMP的分子特性构建了Ins-PMP复合物，并在体外细胞水平初步评价其作为递送载体的可行性。表征结果表明，当胰岛素与PMP质量比为1:4（w/w）时，复合物发生结构重组，形成以α-螺旋和β-折叠为主导的均匀球形组装体，在指定实验条件下结构稳定性高于单独胰岛素。体外Caco-2细胞模型评价表明，在0-200 μg/mL浓度范围内，复合物对细胞活力无显著影响（P>0.05），且不破坏细胞单层完整性；在相同实验条件下，复合物组胰岛素细胞摄取效率比游离胰岛素组高21.64%，跨膜转运效率高73.18%；且该效应在测试的摩尔比和剂量范围内呈现一定依赖性。上述体外实验结果表明，PMP作为一种天然来源材料，在Caco-2细胞模型中表现出良好的细胞相容性和跨膜递送能力，提示其具有作为递送载体进行进一步研究的潜力。本研究建立的复合物构建策略为口服胰岛素制剂的体外递送研究提供了替代技术途径，并为其他蛋白或多肽药物口服递送系统的体外设计提供了方法学参考。需明确指出，目前所有结论基于体外细胞实验，后续研究需进一步利用模拟胃肠消化模型和体内动物实验系统评价复合物的酶稳定性、跨膜转运效率及药效学性能，以全面验证其口服应用可行性。本研究从水产副产物资源化利用出发，延伸至功能性肽组分的制备及其体外递送能力的初步探索，为水产副产物在生物医学领域的潜在应用提供了基础方法学依据和实验数据。
