基于多组学与实验验证探讨丹参素靶向凋亡性脑卒中治疗的分子机制

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Exploring the molecular mechanism of Danshensu targeting PANoptosis therapy for stroke based on multi omics and experimental verification

　　摘要
背景：中风后神经损伤加重的关键因素之一是炎症反应与细胞死亡之间的相互作用。PANoptosis是一种包含坏死性凋亡、焦亡和凋亡在内的混合型细胞死亡方式，其在中风病理生理过程中的作用至今尚不清楚。
目的：本研究旨在通过多组学分析系统识别与中风相关的PANoptosis核心基因，并探讨丹参素这一丹酚酸类活性成分的干预机制。
方法：我们结合GSE16561和GSE22255转录组数据集进行差异表达分析、加权共现网络分析及免疫浸润评估；利用GSE174574单细胞数据研究细胞异质性及细胞间通讯网络；通过网络药理学和分子对接预测丹参素的潜在靶点；最后以BV-2小胶质细胞OGD/R模型进行实验验证，并以ZBP1 siRNA敲低作为功能对照。
结果：共鉴定出10个PANoptosis核心基因（ZBP1、CASP8、TNF、SIRT1、MAPK3、MAPK1、TLR4、NLRP3、MLKL、HMGB1），这些基因主要富集在坏死性凋亡、TNF信号通路以及细胞质DNA检测通路中。中风患者体内存在显著的中性粒细胞和M0型巨噬细胞浸润，单细胞数据表明巨噬细胞/小胶质细胞是TNF和MIF信号网络的中心节点。网络药理学筛选出丹参素的7个潜在靶点（TLR4、NLRP3、SIRT1、MAPK1、MAPK3、TNF、CASP8）。分子对接分析显示，丹参素与TNF、MAPK1和NLRP3的结合能低于-5千卡/摩尔。体外实验证实，丹参素能显著抑制OGD/R诱导的ZBP1及其下游效应分子CASP8、NLRP3、MLKL的蛋白水平升高，逆转SIRT1表达下调及TLR4/ERK磷酸化，其效果与ZBP1 siRNA敲低相似。
结论：我们的研究结果表明，丹参素可能通过调控PANoptosis相关信号网络来控制巨噬细胞的炎症反应及程序性细胞死亡相关信号传导，进而调节中风后的免疫环境。尽管仍需通过激活状态标志物（如p-MLKL、裂解型CASP8）进一步验证，但本研究为中风治疗提供了新的分子靶点及理论依据。

引言
中风是中国成年人死亡和残疾的主要原因，其中缺血性中风占比约为70%-80%[1]。目前临床治疗主要依靠静脉溶栓和机械取栓术，但由于治疗时间窗口较短且存在再灌注损伤，这些方法的广泛应用受到限制[2,3]。中风后的病理过程极为复杂，包括兴奋毒性、氧化应激、神经炎症以及多种类型的细胞死亡。这些事件相互交织，形成级联放大效应，最终导致不可逆的神经功能障碍[4,5]。因此，深入研究中风后神经损伤的关键调控节点并寻找有效的治疗靶点具有重要的临床意义。

近年来，一种被称为“PANoptosis”的新型程序性细胞死亡方式引起了广泛关注。PANoptosis是一种独特的炎症性和溶解性细胞死亡途径，由称为PANoptosome的多蛋白复合体调控，该复合体受caspases和受体互作蛋白激酶（RIPKs）驱动。与传统单一死亡方式不同，PANoptosis将焦亡、凋亡和坏死性凋亡三种途径有机整合在一起，具备这三种途径的核心特征，但无法用任何单一途径完全解释其机制[6,7]。当检测到病原体、病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）或下游细胞因子时，PANoptosome便会组装起来。目前，PANoptosis已被确认为炎症性细胞死亡的主要调控因子，成为下一代免疫干预的重要靶点。在感染、无菌性炎症及多种疾病中，PANoptosis通过整合关键传感器和效应分子，同时激活多种细胞死亡途径，发挥重要的病理防御作用[8,9]。ZBP1等分子可触发PANoptosis，它能同时激活凋亡、坏死性凋亡和焦亡三种途径。Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）是一种细胞质核酸传感器，在炎症和细胞死亡途径中起关键中介作用。Mutoh等人利用小鼠光致血栓性中风模型，系统研究了中风后大脑中ZBP1的时空表达特征。实时定量PCR检测显示，中风后第3天至第14天ZBP1开始表达。免疫组织化学染色表明，ZBP1的免疫反应主要位于梗死周围Iba1阳性的小胶质细胞/巨噬细胞中。中风后第7天至第14天，ZBP1阳性细胞以分层形式分布在梗死核心周围。值得注意的是，脑膜中的CD206阳性边界相关巨噬细胞（BAMs）中也检测到了ZBP1的免疫反应。进一步的共定位分析显示，表达ZBP1的细胞同时表达Toll样受体4（TLR4）、Toll/IL-1R结构域含有的干扰素-β诱导因子（TRIF）以及受体互作丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）等炎症介质。共聚焦显微镜形态学分析表明，葡萄糖氧化酶（GOx）处理可增强ZBP1与其适配器TRIF的共定位信号，而GOx处理已被报道可诱导线粒体DNA（mtDNA）释放[10]。上述结果表明，ZBP1在梗死周围的小胶质细胞/巨噬细胞中表达升高，可能在中风后涉及mtDNA的DAMPs介导的神经炎症途径中发挥重要作用。这一发现为理解ZBP1在缺血性脑损伤中的病理生理意义提供了重要的时空表达证据，同时也提示ZBP1可能成为中风后神经炎症干预的潜在靶点。

近年来，ZBP1被确定为pan apoptosis的关键调控因子，靶向Zbp1-Ripk3轴可通过抑制pan apoptosis来减轻缺血性神经元损伤。其中，CASP8负责启动凋亡，MLKL参与坏死性凋亡，而NLRP3炎性小体则驱动焦亡及IL-1β的成熟。这三者共享上游调控信号并相互协作，可能会加剧组织损伤[11]。需要指出的是，pan apoptosis在神经系统疾病中的病理意义越来越受到重视。在帕金森病、阿尔茨海默病和创伤性脑损伤中，pan apoptosis的激活与疾病进展和预后密切相关，这凸显了其作为治疗靶点的潜力。由于神经系统再生能力有限且能量需求高，因此对pan apoptosis尤为敏感。先前的研究表明，pan apoptosis与神经炎症之间存在密切关联，二者受复杂的分子机制调控，共同参与神经疾病的病理过程[12,13,14]。此外，pan apoptosis在缺血再灌注损伤（IRI）中的作用也逐渐受到关注。然而，目前仍缺乏关于中风后pan apoptosis的激活状态、细胞来源及调控机制的系统性研究。ZBP1在中风病理过程中的具体作用及其作为药物靶点的可行性仍有待进一步探索。

中风后损伤的主要原因是免疫炎症。中风后的炎症微环境由外周免疫细胞浸润和中枢小胶质细胞活化共同构成。中风后，重要的先天免疫细胞——巨噬细胞会极化为促炎型（M1）或抗炎型（M2）表型，而它们的死亡方式会直接影响炎症的进程[15,16]。单细胞转录组测序技术的进步为研究中风后免疫细胞的异质性及细胞间通讯网络提供了前所未有的机会，有望揭示PANoptosis在特定细胞亚群中的功能特性。

丹参多酚酸（DSPA）是传统中药丹参中的主要水溶性成分，具有活血化瘀的功效，临床上常作为缺血性脑血管疾病的辅助治疗药物[17]。其活性代谢物丹参素具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多种药理作用，但目前尚无证据表明它可通过调控PANoptosis发挥神经保护作用[18]。网络药理学和分子对接技术为系统预测传统中药的多靶点作用机制提供了有力工具。

为为丹参素治疗中风提供新的分子机制依据，本研究结合转录组测序、免疫浸润分析、单细胞转录组学、网络药理学及体外实验验证，系统筛选与中风相关的PANoptosis核心基因，分析其在免疫细胞中的表达特征，评估丹参素的多靶点结合能力，并利用OGD/R诱导的小胶质细胞模型验证其调控作用。

部分章节内容
转录组数据的批量分析与差异分析：从GEO数据库中获取与中风相关的转录组数据集GSE16561和GSE22255。所有分析均基于R语言，使用Sangerbox 3.0和Oebiotech云平台完成[19]。获取原始数据后，用Sangerbox将基因ID转换为标准化矩阵，随后采用COMBAT技术消除批量效应并整合两个数据集。为了筛选差异表达基因，使用Limma程序并设定差异倍数阈值。

转录组差异分析及模块分析结果：从GEO数据库下载转录组数据，GSE16561数据集共包含63个样本，其中24个为正常对照组，39个为中风患者；GSE22255数据集的40个样本分为20个中风组和20个正常组，总计103个样本。根据交叉分析生成的条形图显示，GSE16561涵盖18168个基因，而GSE22255包含20549个基因（见图1A）。由于两个数据集存在差异，因此需要进行批量效应校正。

讨论
通过结合转录组测序、免疫浸润分析、单细胞转录组学、网络药理学及体外实验，本研究系统分析了中风后PANoptosis的病理后果以及丹参素这一丹酚酸类活性成分的干预机制。研究发现，包括ZBP1、CASP8、TNF、NLRP3、MLKL、HMGB1在内的PANoptosis核心基因在中风患者中显著上调，且富集在坏死性凋亡和TNF信号通路中。

结论
本研究系统揭示了中风后PANoptosis的重要性，同时阐明了丹参素通过靶向PANoptosis途径产生神经保护作用的分子机制。免疫浸润分析证实，巨噬细胞和小胶质细胞是PANoptosis的主要载体。PANoptosis的核心基因，如ZBP1、CASP8、NLRP3和MLKL，在中风患者中显著上调，且富集在坏死性凋亡和TNF信号通路中。

临床试验编号：不适用。
作者贡献声明：Hui Qin：写作——审阅与编辑、概念设计；Yuhan Su：写作——初稿撰写、正式分析；Haifeng Huang：监督、研究实施。

数据可用性声明：所有数据均存在于手稿及/或支持信息文件中。

伦理审批与参与同意：不适用。

出版同意：不适用。

利益冲突：作者声明没有利益冲突。

资金支持声明：无。

利益冲突声明：作者声明没有利益冲突。

致谢：感谢KEGG在线平台提供原始数据。同时感谢BioBean（生信豆芽菜）团队提供的用户友好型生物信息学平台（http://www.sxdyc.com/），该平台极大简化并加快了我们的研究进程。

Yuhan Su | Haifeng Huang | Hui Qin
中国广西壮族自治区南宁市广西中医药大学附属广西国际壮医医院神经科