基于RGB技术的微藻密度测量中背景干扰的定量分析

《Biomass and Bioenergy》：Quantitative analysis of background interference for robust RGB-based microalgae density measurement

　　

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  研究人员设计了一种经济高效的集成系统，用于评估微藻的密度。
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  为实现更准确且灵活的曲线拟合，研究提出了自适应多项式模型。
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  对于Nannochloropsis sp.和，平均准确率分别可达0.92和0.87。
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  该研究阐明了背景颜色对成像精度的复杂影响。
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  研究还提供了针对不同物种选择最佳背景颜色的指南。

引言

全球向可持续生物经济的转型，使得对微藻生物量进行快速、准确且可大规模监测的需求愈发迫切。微藻的应用范围广泛，从监测有害藻华到优化高价值生物制品及碳中性生物燃料的生产[[1], [2], [3], [4], [5]]。目前，人们通常通过细胞计数、光密度（OD）和干细胞重量（DCW）来评估微藻的丰度和生物量。细胞计数虽能直接得出密度估算值，但耗时且受操作者影响较大；光密度检测速度快且无损，却易受细胞碎片和色素差异的影响；而干细胞重量虽能直接反映生物量，但需要耗时采集和干燥，无法实现实时监测[[6], [7], [8], [9]]。虽然有一些先进技术可实现高通量或多参数检测，但它们的灵敏度和成本差异较大。流式细胞术可用于单细胞分析，而荧光法和拉曼法则则能识别色素、生理状态及营养物质[[10], [11], [12], [13], [14], [15]]。在微藻生物反应器中，拉曼检测的下限因检测目标不同而有所差异，一般在0.016至0.50克/升之间[14]，而商用现场荧光仪的价格则在2000美元到30000美元不等[16]。这些例子表明，尽管先进方法具备强大的分析能力，但其针对特定目标的性能以及所需的专用仪器、校准条件和专业技能，往往限制了其在大规模常规应用中的使用。

光学检测则是一种非侵入式的替代方法。根据监测规模和传感配置的不同，光学检测方法可分为三种互补的检测模式：实验室微观成像、近距感应以及生态系统规模的遥感监测[[17], [18], [19], [20], [21]]。这三种模式分别主要用于细胞层面、培养系统层面以及区域尺度层面的监测。微观成像侧重于详细的细胞结构分析[22]，而遥感监测则能覆盖更大范围的空间，其检测效果取决于大气条件、云层覆盖情况以及空间分辨率等因素[23]。那些集成有光电二极管、光谱仪或CMOS传感器的近距光学系统，尤其适合用于实时生物过程监测（见图1a）[[24], [25], [26], [27]]。其中，结合成像技术与计算算法的方法展现出巨大潜力，它们能够利用色彩和形态特征来推断生物量，而无需进行破坏性取样[[28], [29], [30]]。

近年来，基于图像的量化技术为低成本微藻监测带来了巨大潜力。Sunoj等人通过线性回归模型和定制的图像分析方法，对八种微藻菌株的干细胞质量进行了估算，其均方根误差仅为0.2至0.4[31]。最近，轻量级的卷积神经网络以及CNN与视觉Transformer相结合的混合架构也被应用于微藻或浮游生物的高效检测与精细分类，不过这些研究主要聚焦于生物体的识别而非密度估算[32,33]。Nguyen等人开发了一种基于相机的系统，通过分析红色和绿色通道的像素强度，其估算误差约为8.6%[34]。Salgueiro等人则利用CCD成像技术，找到了RGB/灰度强度与生物量浓度之间的关联，其相关系数R²高达0.97[35]。除了具备良好的预测性能外，基于图像的监测方法还具有较高的经济性；例如，有一种基于树莓派相机的微藻密度估算平台，其成本据称仅约为150美元[36]。即便在预测性能和经济性方面都有所提升，但基于图像的监测方法在不同成像条件下的稳定性仍需进一步研究。尤其是背景色彩、标准化背景水平、表面纹理以及照明强度等因素的影响，至今尚未得到系统性的评估，而且针对不同微藻物种的验证工作也相对有限。由于大多数基于RGB的技术采用固定的成像配置，将背景视为校准环境的一部分而非独立的实验变量，因此背景干扰问题往往没有受到足够重视。这样一来，背景的影响可能被纳入拟合模型参数之中，而无法单独进行分析。这些知识空白使得基于图像的模型在不同于校准条件的成像环境中的应用变得复杂。

为此，本研究旨在解答三个问题：（1）背景色调、标准化背景水平、表面纹理、照明强度以及物种特有的色素成分，如何影响基于图像的微藻密度估算？（2）在这些成像条件下，带符号的RGB差异值如何随微藻密度的变化而变化？（3）是否可以通过一种保留向量特性的多变量多项式模型，来实现在不同背景和物种条件下的可靠密度估算？为了解决这些问题，我们开发了一个模块化平台，该平台整合了市售的便携式色度计和LED面板，这些LED面板的照明强度和位置均可调节，同时还配备有定制设计的可更换背景装置。与灰度处理、单通道处理或标量色彩距离计算方法不同，我们的方法直接根据带符号的ΔR、ΔG和ΔB值来建模。由于保留了各通道的定向信息以及通道间的相互作用，该模型能够呈现出不线性且受背景影响的色彩变化趋势，而这些趋势在采用标量转换时往往会丢失。因此，本研究的创新之处在于将系统的背景干扰分析、保留向量特性的RGB建模以及可配置的低成本平台相结合，而不仅仅依赖于多项式回归。这一框架为我们提供了关于成像条件如何影响测量精度的新见解，同时也为实现可靠的微藻监测提供了实用指导。

章节节选

RGB计算方法

在理想条件下，诸如CCD和CMOS传感器之类的数字RGB图像传感器，会对入射的光通量或光强度呈现出近似线性的响应：入射光强度越高，传感器产生的电信号就越强，经过模数转换后的数字化RGB数值（0-255）也就越大[37]。这种关系大致遵循以下公式：I_out?=?k?I_light?+?b（其中k为增益系数，b为暗电流）

微藻培养

Nannochloropsis sp.和. galbana这两种微藻的培养样本，是从广东海洋大学的藻类资源开发与环境修复实验室获得的[49,50]。这两种微藻都是在经过消毒处理的5升玻璃瓶中培养的，所使用的培养基为改良后的f/2天然海水培养基，其配方参照了先前已发表的实验室方案[51,52]。该培养基由过滤后的天然海水构成，其中还加入了5毫升的硝酸钠（NaNO₃）储备液（浓度为75克/升），以及单钠

微藻与LED的特性分析

图2a中的显微图像显示，这两种微藻都具有球形细胞结构，且具有不同的色素特征。Nannochloropsis sp.（左侧）的细胞呈绿色，为单个细胞，直径大约在2-5微米之间，均匀分布在视野中。这类细胞表面有一层薄的透明黏液层，整体形态较为规则。而（右侧）的细胞则是完美的球形，呈金黄色，大小也与前者相近（约2-5微米）

结论

本研究开发了一种低成本的集成系统，并研究了背景颜色、标准化背景水平、表面纹理以及照明强度等因素，对基于RGB技术的微藻密度测量所产生的影响，测试对象为Nannochloropsis sp.和。在所选的灰色背景条件下，该系统对这两种微藻的密度估算，其平均相对准确率分别为0.92和0.87，对应的R²值则分别为0.94和0.98。研究结果表明，与

CRediT作者贡献说明

陈海云： 方法设计，论文初稿撰写。张乔阳： 数据整理，实验研究，方法设计。江千楠： 数据整理，实验研究。David Kwame Amenorfenyo： 论文审阅与编辑。胡张曦： 资源提供。李峰： 概念构思，资源提供，项目监督。肖华： 概念构思，资金筹集，项目管理，论文审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号为62304054、62171143）、广东海洋大学科研启动基金（编号为060302112101）以及湛江市海洋青年人才创新计划（资助编号为2025R02107）的支持。

Haiyun Chen|Qiaoyang Zhang|Qiannan Jiang|David Kwame Amenorfenyo|Zhangxi Hu|Feng Li|Hua Xiao