一种基于亚硫酸氢盐预处理区分HBV cccDNA与rcDNA的新型高特异性qPCR检测方法

《Journal of Virology》：A novel highly specific qPCR assay for distinguishing HBV cccDNA from rcDNA following bisulfite pretreatment

　　

共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续性存在是慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染的基础，也是实现功能性治愈的主要障碍。准确且灵敏地定量cccDNA对于评估治疗策略至关重要。传统定量PCR（qPCR）缺乏区分cccDNA与病毒松弛环状DNA（rcDNA）及其他复制中间体的特异性，而核酸酶预处理（如质粒安全ATP依赖性核酸酶、外切核酸酶I/III或T5外切核酸酶）可能不完全消化rcDNA和/或存在过度消化cccDNA的风险。在此，研究人员评估了一种新型专利化的基于亚硫酸氢盐转化的cccDNA（BSC-cccDNA）qPCR平台，该平台利用亚硫酸氢盐处理破坏rcDNA的互补性，随后使用靶向rcDNA缺口区域的引物组进行qPCR，从而实现cccDNA的选择性扩增。利用合成的HBV DNA对照以及从HBV稳定细胞系和HBV感染细胞中提取的DNA样本，研究人员证明BSC-cccDNA qPCR检测具有高特异性，每反应可耐受高达10⁹拷贝的rcDNA，并灵敏至10拷贝的cccDNA。与灵敏的数字PCR（dPCR）、跨缺口qPCR和Southern印迹的比较分析进一步验证了BSC-cccDNA检测的灵敏度和准确性。这些发现确立了BSC-cccDNA qPCR检测作为标准化cccDNA测量的可靠工具，并凸显了其在基础研究和临床应用中的潜力。

**研究背景与科学问题**
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共卫生问题，约影响2.96亿人，每年导致近100万人死于相关肝病（包括肝硬化和肝细胞癌）。当前以核苷（酸）类似物（NUCs）为主的抗病毒疗法虽能有效抑制病毒复制，却极少实现完全病毒学治愈，根本原因在于其无法清除病毒持续存在的游离型基因组——共价闭合环状DNA（cccDNA）。cccDNA定位于感染肝细胞核内，作为所有病毒RNA的稳定转录模板，是病毒持续存在及停药后复发的分子储库。因此，准确灵敏地定量肝内cccDNA对阐明HBV持续性机制以及临床前和临床评估靶向cccDNA的新型抗病毒药物均至关重要。然而现有检测方法存在固有技术局限：Southern blot虽能直接可视化cccDNA，但操作繁琐且定量不敏感；传统qPCR即使采用跨缺口引物，仍会在两轮扩增后从rcDNA产生假PCR产物，理论上使跨缺口qPCR的特异性降至25%；为提高特异性而采用的核酸酶预处理（如质粒安全ATP依赖性核酸酶PSAD、外切核酸酶I/III、T5外切核酸酶）存在rcDNA去除不完全或cccDNA过度消化的风险，且不同方案间变异性大，难以实现标准化。为应对上述挑战，研究人员评估了一种新型专利化的基于亚硫酸氢盐转化（BSC）的cccDNA qPCR检测平台（BSC-cccDNA v55和v300），并系统验证其性能。该研究发表于《Journal of Virology》。

**关键技术方法**
研究构建了含单体HBV基因型D基因组（GenBank登录号U95551.1）的pGEM-3Z-H100质粒作为cccDNA对照；合成了由三条寡核苷酸组装、模拟rcDNA负链缺口/瓣结构的合成rcDNA（srcDNA，nt 1733–1912）。从tet诱导的HepAD38细胞中提取细胞质HBV核心DNA（含衣壳相关复制中间体）和Hirt DNA（含cccDNA与去蛋白rcDNA）；原代人肝细胞（PHH）感染HBV后提取Hirt DNA。样本经JBS BSC Kit进行亚硫酸氢盐转化后，分别采用BSC-cccDNA v55（55 bp扩增子，nt 1792–1846，靶向DR1区域）和v300（300 bp扩增子，nt 1547–1846，含内部探针，靶向DR2-DR1区域）qPCR检测；以HBV1655和HBV1778 qPCR定量总HBV DNA；以T5/T7外切核酸酶消化结合数字PCR（dPCR）定量PHH来源cccDNA；以Southern blot杂交金标准评估不同预处理效果；对16例治疗初治慢性乙型肝炎（CHB）患者肝组织总DNA样本进行检测，并通过Sanger测序和Spearman秩相关分析进行验证。

**研究结果**
**亚硫酸氢盐转化赋予跨缺口cccDNA PCR对rcDNA的高特异性**：在高达10⁹拷贝srcDNA存在下，BSC-cccDNA v55仍能稳定检测100拷贝H100 cccDNA对照（150–180拷贝），srcDNA单独输入时无扩增信号。但使用生物学来源的HBV核心DNA时，输入≥10⁵拷贝出现信号，可能与核心颗粒内异质性复制中间体有关（约占输入HBV DNA的0.1%）。v300检测在核心DNA存在下特异性略高于v55，但定量信号较低，与BSC诱导DNA片段化后短扩增子扩增效率更高一致。

**BSC-cccDNA检测的灵敏度与线性**：v55检测可稳定检出10拷贝H100，线性定量范围10–10⁶拷贝；v300检出限为10拷贝，但可靠定量需>100拷贝，线性范围10²–10⁷拷贝。

**亚硫酸氢盐转化不影响短扩增子qPCR对cccDNA的定量**：对5份独立PHH感染样本的Hirt DNA经T5/T7外切核酸酶处理后，dPCR与BSC-cccDNA v55定量结果总体相当（如样本5分别为279与259拷贝），表明BSC未显著降低模板可用性。

**以Southern blot为参照比较BSC-cccDNA qPCR与其他cccDNA检测方法**：对HepAD38来源核心DNA和Hirt DNA进行热变性±PSAD、Exo I/III、T5 exo或BSC处理后分析。Southern blot显示Exo I/III和T5 exo虽能去除DP-rcDNA，但也使cccDNA信号明显降低（分别为未酶解处理的83.7%和46.6%）；BSC处理因改变HBV序列而无法与探针杂交。BSC-cccDNA v55和v300定量结果（分别为1,102,500和892,500拷贝）约占未处理总HBV DNA（10,700,000）的10%，与Southern blot估算一致，表明BSC方法无需核酸酶预处理即可反映天然cccDNA水平。

**BSC-cccDNA检测用于肝活检样本**：对16例CHB患者肝组织总DNA检测显示，多数样本v300定量值低于v55，与扩增子大小差异一致；样本L14出现v300高于v55的异常，Sanger测序发现其v55反向引物结合位点存在双点突变（1811G>T和1814C>T），影响引物退火。Spearman相关分析显示，血清病毒载量与v300定量cccDNA强相关（ρ=0.79，P<0.001），而与v55定量无显著相关（ρ=0.35，P=0.18）；肝内总HBV DNA与v55定量强相关（ρ=0.87，P<0.001），与v300中等相关（ρ=0.54，P=0.03）。

**讨论与结论**
讨论部分指出，短扩增子v55检测的灵敏度与dPCR相当，因短扩增子有效降低了BSC引发DNA片段化对PCR效率的影响；v300检测通过内部探针和更长的负链连续性要求增强了特异性，适用于优先考虑最大特异性的应用场景。引物采用寡核苷酸鸡尾酒设计，可同时识别甲基化和非甲基化胞嘧啶转化后的序列，以适应临床样本中cccDNA模板的甲基化状态差异及HBV序列多样性。与核酸酶预处理策略相比，BSC方法避免了rcDNA不完全消化和cccDNA过度消化的问题，更真实地反映cccDNA在总HBV DNA中的比例（约8–10%）。研究局限性包括：未系统评估对非rcDNA非cccDNA HBV DNA物种（如双链线性DNA和整合DNA）的特异性；HBV序列异质性可能影响引物结合效率及定量准确性；需更大规模的独立队列进一步验证临床实用性。研究结论：BSC-cccDNA qPCR检测是一种兼具高特异性、高灵敏度与定量准确性的可靠工具，可作为标准化cccDNA测量的可行平台，在HBV基础研究和治愈性治疗策略开发中具有重要应用价值。