《Brain Research》：Perineuronal nets preferentially surround parvalbumin interneurons in the prelimbic cortex: A rat and mouse comparison
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摘要近期研究显示，神经周围网状结构在调节神经元功能与可塑性方面起着重要作用。功能性研究越来越多地通过操控这些神经周围网状结构来探究其在学习与记忆中的作用，但解读这类实验结果需要了解这些网状结构包围了哪些类型的细胞，而目前对于某些脑区的这类信息仍不完整。本研究以边缘前皮质为研究对象
摘要
近期研究显示，神经周围网状结构在调节神经元功能与可塑性方面起着重要作用。功能性研究越来越多地通过操控这些神经周围网状结构来探究其在学习与记忆中的作用，但解读这类实验结果需要了解这些网状结构包围了哪些类型的细胞，而目前对于某些脑区的这类信息仍不完整。本研究以边缘前皮质为研究对象，旨在确定雄性大鼠和小鼠中特定类型中间神经元及锥体细胞被神经周围网状结构包围的比例。我们运用免疫组化技术检测含有微小蛋白、谷氨酸脱羧酶以及/或钙激酶II的边缘前皮质细胞，同时使用紫藤凝集素来识别神经周围网状结构。统计了具有上述标志物的细胞数量，并计算出被神经周围网状结构包围的细胞比例。在所检测的细胞类型中，无论是大鼠还是小鼠，表达微小蛋白的中间神经元与神经周围网状结构的关联频率最高，其次是表达谷氨酸脱羧酶的中间神经元。在大鼠和小鼠中，没有表达钙激酶II的细胞被神经周围网状结构包围。而在小鼠中，仅表达微小蛋白或仅表达谷氨酸脱羧酶的细胞比大鼠更易被神经周围网状结构包围。在两种物种中，都有一小部分未被检测到相应免疫标记的细胞也被神经周围网状结构所包围。这些研究结果表明，微小蛋白阳性中间神经元最有可能位于边缘前皮质的第5/6层中被神经周围网状结构包围，但物种间的差异提示，在设计及解读涉及神经周围网状结构操作的实验时需格外谨慎，尤其是在将大鼠与小鼠模型进行比较时。
引言
神经周围网状结构是一种特殊的细胞外基质，它环绕着某些神经元的胞体及其近端树突（Celio和Blumcke，1994）。这类网状结构由硫酸软骨素蛋白聚糖以及其他细胞外蛋白质组成（Celio和Blumcke，1994），存在于整个中枢神经系统中（Seeger，1994），包括边缘前皮质（Yu，2020）。已有研究表明，神经周围网状结构与抑郁、成瘾、记忆、可塑性以及关键期发育密切相关（Yu，2020；Slaker等人，2016；Wang和Fawcett，2012）。它们能够调控所包围神经元的功能，保护神经元免受氧化应激损伤（Cabungcal，2013），同时作为支架限制新突触的形成（Deepa，2002），并有助于突触的稳定（Wang和Fawcett，2012）。综上可知，神经周围网状结构主要作用于其所包围的细胞，因此明确它们包围了哪些类型的细胞至关重要。
神经周围网状结构存在于内侧前额叶皮质的边缘区域（Yu，2020；Paylor，2016；Ueno，2017），在研究药物寻求行为与认知灵活性时越来越受到关注，但该区域内被其包围的细胞类型尚未被完全阐明。已有研究在边缘前皮质中发现了围绕微小蛋白阳性中间神经元的神经周围网状结构（Fawcett等人，2019；Carceller，2020），但尚不清楚它们是否也包围其他类型的细胞。这一空白值得重视，因为其他脑区的研究表明，神经周围网状结构并非只存在于微小蛋白阳性细胞中——例如，在多个皮质及皮下区域，锥体神经元也存在着神经周围网状结构（Alpar，2006；Hausen，1996；Bruckner，1999；Hartig，1999；Lensjo，2017；Morikawa，2017）。有一些小鼠相关研究专门聚焦于带有神经周围网状结构的微小蛋白阳性细胞（Ueno，2017），但该研究并未明确检测锥体神经元周围是否存在神经周围网状结构。
在本研究中，我们利用免疫荧光技术识别边缘前皮质第5/6层中被神经周围网状结构包围的中间神经元与锥体细胞。我们系统地分析了大鼠和小鼠边缘前皮质第5/6层的中间神经元及锥体细胞被神经周围网状结构包围的概率。我们使用紫藤凝集素来标记神经周围网状结构，微小蛋白以及谷氨酸脱羧酶则用于识别不同类型的中间神经元，而钙调蛋白依赖性蛋白激酶II则用于标记锥体细胞。此外，本研究还将比较大鼠与小鼠边缘前皮质第5/6层中的神经周围网状结构分布情况，以此了解这两种最常被用于实验的物种之间的差异。这种方法首次实现了对边缘前皮质中神经周围网状结构分布的跨物种、按细胞类型细分的分析，为解读那些旨在破坏或操控该区域神经周围网状结构的功能性研究提供了重要依据。
章节节选
方法
本研究使用了3只9周大的雄性长埃文斯大鼠和4只6周大的C57BL/6J小鼠，这些动物以同性别配对的方式饲养，可随时获取食物和水，饲养环境遵循12/12小时的明暗周期，小鼠的起始时间为06:00，大鼠则为07:30。大鼠和小鼠均在性成熟后开始被用于实验，通常认为大鼠的性成熟年龄在5至9周之间（Lewis，2002），而小鼠则在5至6周之间（Bryda，2013）。所有实验方案均获得了俄勒冈健康与科学大学或Legacy研究机构动物使用与护理委员会的批准。
结果
我们在内侧前额叶皮质的第5/6层中发现了表达微小蛋白、谷氨酸脱羧酶以及钙激酶II的细胞（见图1的A-F），其中一些细胞同时表达微小蛋白和谷氨酸脱羧酶（见表1）。在对细胞进行计数后，我们进一步判断每个细胞是否被神经周围网状结构包围。由于有一部分被神经周围网状结构包围的细胞缺乏微小蛋白、谷氨酸脱羧酶或钙激酶II的免疫反应性，因此我们从两个角度对这些标志物进行了量化：一是该切片中具有免疫反应性的细胞总数（无论是否与神经周围网状结构相关），二是不同标志物对应的神经周围网状结构数量。
讨论
本研究从双向角度分析了边缘前皮质深层（第5/6层）中神经周围网状结构与不同类型细胞之间的关系，既量化了特定神经元群体被神经周围网状结构包裹的概率，也分析了单个神经周围网状结构与特定细胞表型关联的可能性。这一研究不仅明确了哪些细胞类型与神经周围网状结构的关联最为密切，还揭示了哪些细胞群体最可能受到神经周围网状结构破坏的影响。此外，通过比较大鼠与
作者贡献说明
Ana E. Jenike： 参与研究。 Travis E. Brown： 负责文章撰写、审阅与编辑工作，以及资金申请。 Soren Impey： 负责文章撰写、审阅与编辑工作，以及资金申请。 Barbara A. Sorg： 负责文章撰写、审阅与编辑工作，同时负责资源协调与数据管理。 Sue A. Aicher： 参与研究。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
作者感谢Deborah Hegarty博士在方法开发方面给予的帮助。本研究得到了美国国家药物滥用研究所提供的R01DA055645号资助（资助人包括Sorg、Aicher、Brown和Impey）。同时，我们也感谢俄勒冈健康与科学大学高级光学显微镜中心的工作人员所提供的专业技术支持（该中心的RRID编号为SCR_009961）。本研究中所使用的计算基础设施由俄勒冈健康与科学大学高级计算机中心提供（该中心的RRID编号为SCR_009959），相关运营工作则得到了该校研究办公室的支持。
Ana E. Jenike|Travis E. Brown|Soren Impey|Barbara A. Sorg|Sue A. Aicher
美国俄勒冈州波特兰市西南萨姆·杰克逊公园路3181号，俄勒冈健康与科学大学化学生理学与生物化学系，邮编97239
