利用苹果渣作为底物的 Rhizopus arrhizus 生物技术生产富马酸

《Reactions》：Biotechnological Production of Fumaric Acid by Rhizopus arrhizus Using Apple Pomace as Substrate

　　

富马酸（fumaric acid, FA）是最重要的生物基化学品之一，在食品、饲料、聚合物、纸浆和制药工业中有应用。为了克服当前石油化工生产过程的局限性，研究人员正在开发替代方法。使用野生型真菌如Rhizopus sp.的生物技术生产是一种有前景的替代方案。在本研究中，研究人员使用苹果渣（apple pomace, AP）作为碳水化合物来源，利用Rhizopus arrhizus NRRL 1526生产富马酸。研究人员的重点是利用直接苹果汁加工产生的苹果渣中大量存在的游离、非结构结合的碳水化合物。研究人员比较了三种工艺：压榨、提取以及两者的组合。研究人员应用了两种培养策略：预培养（pre-culture）和单独上游生物量生产（separate upstream biomass production）。使用预培养方法，从合成苹果渣汁中实现了68.3 g/L的富马酸滴度，得率为0.53 g/g，生产力为0.29 g/(L·h)。单独生物量生产使得生长解耦的富马酸生产成为可能，从合成和真实苹果渣汁中分别获得50.2 g/L和79.3 g/L，得率分别为0.82 g/g和0.54 g/g，生产力分别为0.17 g/(L·h)和0.27 g/(L·h)。因此，展示了苹果渣用于富马酸发酵生产的有效利用。

### 论文解读：利用苹果渣通过Rhizopus arrhizus生物技术生产富马酸

#### 研究背景与问题
富马酸（fumaric acid, FA）是一种不饱和二羧酸，被确定为最重要的生物基化学品之一，广泛应用于食品、饲料、聚合物、纸浆和制药工业。当前富马酸主要通过石油化工路线（如丁烷、丁烯或苯的异构化）生产，但化石资源日益枯竭和气候变化加剧，迫切需要开发替代资源和可持续的生产方法。向循环经济转型，利用农业和工业残余物作为新资源是关键策略。苹果渣（apple pomace, AP）是苹果汁加工过程中产生的大量压榨残余物，全球每年约产生400万吨，但大部分未被利用。苹果渣含有丰富的可溶性糖（葡萄糖、果糖、蔗糖）和结构性多糖，具有作为生物炼制碳源的潜力。然而，现有利用苹果渣发酵生产富马酸的研究中，滴度（titer）、得率（yield）和生产力（productivity）仍不理想。本研究旨在评估苹果渣作为底物用于Rhizopus arrhizus NRRL 1526生产富马酸的可行性，并优化工艺以提高过程效率。

#### 研究内容与意义
研究人员开展了系统性的研究，包括苹果渣成分分析、糖液制备工艺比较、糖液纯化、以及两种培养策略（预培养和生长解耦生产）的测试。结果表明，通过组合压榨和两步水提取，再经纯化获得的苹果渣汁，结合单独生物量生产策略，可实现高达79.3 g/L的富马酸滴度，得率为0.54 g/g，生产力为0.27 g/(L·h)。这些值是目前基于非纯葡萄糖替代底物报道的最高值。该研究为苹果渣的高值化利用提供了新途径，推动了循环经济和生物经济。论文发表在《Reactions》。

#### 主要关键技术方法
1. **苹果渣来源与成分分析**：苹果渣来自德国riha WeserGold公司直接苹果汁加工的压榨残余物（2016年5月）。通过干物质、灰分、氮含量（凯氏定氮法）以及糖组成分析（水溶性糖提取和两阶段酸水解结合高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD））确定其总糖含量为66.5%（干重）。
2. **糖液制备工艺**：比较了三种方法：单独压榨（20 bar, 20 min）、三步水提取（苹果渣/水=2:1, w/w）及组合法（先压榨后两步提取）。最终选择组合法，结合热浓缩（90°C）将糖浓度调至100-130 g/L。
3. **糖液纯化**：先以1% (w/v) CaCO₃沉淀浊度，再通过阳离子交换柱（Dowex 50WX8）两次处理，去除浊度和铵离子，得到澄清的苹果渣汁。
4. **培养策略**：采用预培养（pre-culture）和单独上游生物量生产（separate upstream biomass production）两种策略。后者通过两阶段预培养生长生物量，洗涤后接种到无氮源的主培养中，实现生长解耦的富马酸生产。
5. **发酵条件**：在500 mL无挡板摇瓶中进行，34°C, 200 rpm，以CaCO₃调节pH至约6.0。产物通过高效液相色谱（HPLC）和离子色谱（IC）分析。

#### 研究结果

**3.1 苹果渣表征**
通过成分分析，苹果渣干物质含量为26.6%，残余水分73.4%，灰分1.2%（干重），氮含量1.1%（干重）。水溶性糖总含量为357 g/kg_DM（DM为干物质），其中果糖占211 g/kg_DM，葡萄糖100 g/kg_DM，蔗糖46 g/kg_DM。结构性糖（纤维素和半纤维素）含量为307 g/kg_DM，以葡萄糖为主。总糖含量为66.5%（干重），表明苹果渣富含游离可溶性糖，适合直接发酵利用。

**3.2 从苹果渣制备糖液**
三种工艺比较：单独压榨得糖浓度110.1 g/L，糖利用率31.7%；三步水提取加浓缩得糖浓度123.4 g/L，利用率74.2%；组合法（压榨+两步提取+浓缩）得糖浓度109.6 g/L（压榨汁）和后续提取液浓缩后总糖浓度约120 g/L，利用率73.6%。综合工艺复杂性和糖收率，组合法被认为最优，并用于后续实验。

**3.3 糖液纯化**
原始糖液呈橙色浑浊，添加1% CaCO₃后沉淀浊度，pH从3.6升至6.3，糖浓度下降1.8%。随后通过阳离子交换柱两次处理，得到澄清浅橙色苹果渣汁，铵离子浓度从10.3 mg/L降至2.7 mg/L，糖浓度下降4.8%。纯化过程有效去除浊度和氮源，有利于生长解耦生产。

**3.4 基于苹果渣汁中糖的培养实验**
测试了果糖、葡萄糖和合成苹果渣汁（含63.7%果糖、30.4%葡萄糖等）的培养效果。

**3.4.1 预培养策略**
使用果糖时，10天后完全消耗，得富马酸72.3 g/L，得率0.49 g/g，生产力0.30 g/(L·h)；葡萄糖培养6天得80.7 g/L，得率0.63 g/g，生产力0.56 g/(L·h)；合成苹果渣汁10天得68.3 g/L，得率0.53 g/g，生产力0.29 g/(L·h)。结果表明葡萄糖是最优底物，果糖也可利用但效率较低。

**3.4.2 单独生物量生产策略**
在无氮条件下，果糖培养12天得46.4 g/L，得率0.67 g/g，生产力0.16 g/(L·h)；葡萄糖7天得57.8 g/L，得率0.73 g/g，生产力0.35 g/(L·h)；合成苹果渣汁12天得50.2 g/L，得率0.82 g/g（超过氧化TCA循环理论值0.64 g/g，表明部分通过还原TCA循环固定CO₂），生产力0.17 g/(L·h)。该策略显著提高得率，但糖代谢速率较慢，导致生产力较低。

**3.5 从纯化苹果渣汁生产富马酸**

**3.5.1 预培养策略**
使用真实苹果渣汁（130 g/L糖）加铵盐时，7天后仅产10.8 g/L富马酸，主要产物为乙醇（22.1 g/L），得率0.10 g/g，生产力0.06 g/(L·h)。不加铵盐时，产量增至16.9 g/L，乙醇降至6.2 g/L，得率0.33 g/g，生产力0.10 g/(L·h)。但生物量形成团块，导致糖代谢不完全，效果不佳，未继续采用。

**3.5.2 单独生物量生产策略**
使用90 g/L糖的苹果渣汁，9天后糖消耗97%，得富马酸52.1 g/L，得率0.60 g/g，生产力0.24 g/(L·h)。使用150 g/L糖的苹果渣汁，12天后糖消耗98%，得富马酸79.3 g/L，得率0.54 g/g，生产力0.27 g/(L·h)。与合成苹果渣汁相比，真实苹果渣汁的糖代谢更完全，但得率略低。此策略实现了高滴度富马酸生产，是目前基于非纯葡萄糖替代底物的最高报道值。

#### 总结讨论与结论
讨论部分指出，与文献中其他使用野生型菌株和农业残余碳源的批次发酵结果相比，本研究获得的富马酸滴度最高，得率处于上游水平，但生产力处于中下游，需进一步优化。研究结论部分翻译如下：
在本研究中，苹果渣被用作碳水化合物原料，用于野生型真菌Rhizopus arrhizus NRRL 1526发酵生产富马酸。所用苹果渣来自直接苹果汁生产，富含游离水溶性碳水化合物。比较了三种获取糖的工艺，最优方案为20 bar压榨20 min，随后进行两步水提取（苹果渣/水=2:1, w/w）。经热浓缩和混合后，液体通过（i）CaCO₃沉淀和（ii）两次通过阴离子交换柱进行纯化，得到纯化真实苹果渣汁，约含65%果糖、30%葡萄糖和5%其他糖，总糖浓度可调。使用单一碳水化合物果糖和葡萄糖，以及合成和真实苹果渣汁进行培养。应用了两种培养策略：预培养法和单独上游生物量生产法以实现生长解耦的富马酸生产。证明虽然葡萄糖是Rhizopus arrhizus NRRL 1526的偏好底物，但果糖也能被代谢，尽管富马酸滴度、得率和生产力略低。使用预培养方法，以合成苹果渣汁为底物，获得68.3 g/L富马酸滴度，得率0.53 g/g，生产力0.29 g/(L·h)。单独生物量生产策略使合成和真实苹果渣汁均能实现生长解耦的富马酸生产。使用合成苹果渣汁时，产生50.2 g/L富马酸，得率高达0.82 g/g，生产力0.17 g/(L·h)，证明部分富马酸通过还原TCA循环产生。使用真实苹果渣汁时，产生79.3 g/L富马酸，得率0.54 g/g，生产力0.27 g/(L·h)。因此，本研究报告的富马酸滴度是基于非纯葡萄糖底物的最高报道值。总体而言，本研究结果明确展示了苹果渣用于富马酸发酵生产的有效利用，相较于其他使用苹果渣的研究有显著改进，为这个尚未充分利用的农业残余物增值开辟了新途径。