综述：研究蛋白质自组装的高通量方法

《Current Opinion in Structural Biology》：High-throughput methods for studying protein self-assembly

　　

生物分子凝聚（biomolecular condensation）已成为细胞组织的核心机制，调控从转录到应激反应的基本过程。其失调——通常涉及从动态凝聚体到更固态或聚集状态的转变——已与人类疾病相关联，因此代表了日益增长的治疗机会。然而，尽管取得了重大进展，精确地将蛋白质序列与凝聚体行为、功能和失调联系起来仍然是一个很大程度上未解决的挑战。高通量方法的最新进展正开始弥补这一差距。通过将大规模诱变与适应性、基于荧光或成像的选择以及深度测序（deep sequencing）相结合，这些方法能够在广泛的序列空间中系统性地探究不同类型的蛋白质自组装。然而，目前大多数可用的检测方法测量的是溶解度、稳定性或细胞适应性等间接读数，并且它们在捕获自组装过程不同参数的方式上存在差异。在此，研究人员综述了新兴的规模化研究蛋白质凝聚和聚集的高通量策略，强调它们真正测量了什么、其局限性，以及这些互补方法之间的相互交流如何能够提供更准确和机制性的序列-组装关系图谱。

### 引言

生物分子凝聚已成为细胞组织的核心机制，调控从转录到应激反应等基本过程。其失调常涉及从动态凝聚体向固态或聚集状态的转变，并与人类疾病相关。序列层面，低复杂度区域和分布性相互作用基序（包括芳香族残基和电荷模式）构成“相互作用语法”，控制凝聚发生、材料性质及向淀粉样纤维的成熟倾向。然而，缺乏对序列-凝聚行为-细胞功能关系的系统理解。现有挑战在于序列变异同时影响蛋白质表达、稳定性、降解、凝聚和向固态淀粉样状态转变等多个方面，需要可扩展的平行实验方法。

### 可扩展的蛋白质自组装测量实验策略（Scalable experimental strategies to measure protein self-assembly）

这类方法的基本流程是：通过易错PCR、简并密码子文库、三核苷酸合成或设计寡核苷酸池生成大型变异文库；对文库施加基于特定表型的选择，使变异富集或耗竭；最后通过深度测序定量变异频率。然而，许多检测方法依赖自我组装的间接后果（如功能丧失、蛋白质丰度下降或报告蛋白折叠受损），主要反映溶解度、稳定性或降解，而不一定是聚集本身。理解每种检测真正报告的内容至关重要。

### 蛋白质稳态偶联的检测方法（Proteostasis-coupled assays）

yTRAP系统将目标蛋白与转录激活因子融合，以荧光报告基因表达与否报告蛋白质可溶性，已用于酵母朊病毒和抗朊病毒筛选，支持阵列和混合文库形式。DHFR融合系统利用二氢叶酸还原酶（DHFR）活性作为聚集报告：可溶性变体使DHFR保持活性并降解甲氨蝶呤，聚集变体则不能，已用于淀粉样蛋白-β（Aβ₄₂）全部变体的聚集倾向定量。三部分β-内酰胺酶测定（TPBLA）将蛋白融合至TEM-1 β-内酰胺酶的两个部分，正确折叠时重构酶活性并提供抗生素抗性，已用于抗体片段、Aβ₄₂、β₂M变体及聚集抑制剂鉴定。Dosa检测通过修饰的细菌tRNA甲基转移酶（TrmA）将蛋白与RNA条形码共价连接，裂解细胞后测序可定量可溶和不可溶部分的变体，其内在控制了蛋白质丰度，但仍主要报告溶解度。这些检测的共同局限是低表达或快速降解的变体可能产生与聚集变体相同的表型。

### 聚集或淀粉样蛋白成核报告系统（Aggregation or amyloid nucleation reporters）

此类报告系统追踪自模板聚集的第一步成核。Sup35N融合报告系统利用酵母朊病毒Sup35的成核结构域，将淀粉样成核偶联到可选择的自养表型（[PSI⁺]），成核变体获得生长优势，已用于Aβ₄₂、IAPP、Bri2衍生延伸、RIPKs及随机序列等数千种人类淀粉样变体的聚集倾向测量。DAmFRET利用分布式多荧光F?rster共振能量转移（FRET）报告成核屏障和朊病毒转换，通过光转换荧光蛋白mEos3.1在单细胞内以浓度依赖性方式检测成核，已用于Sup35、polyVPGVG、CARD9、SARM1、TDP-43、多聚谷氨酰胺及BCL-10等序列，并能区分单体、凝聚样中间态和淀粉样/朊病毒状态。mEos基传感器还可用于其他细胞模型，如Chlebowicz等利用mEos FRET测量野生型α-突触核蛋白纤维对所有变体的交叉播种能力。另一种FRET传感器将目标蛋白与HaloTag融合，用供体和受体配体标记形成FRET对，已用于数千个α-突触核蛋白变体的聚集图谱。这类检测受蛋白质浓度影响，且融合构建体可能改变蛋白行为，荧光分选的噪声较大、可扩展性略低于适应性选择。

### 基于成像的方法（Imaging-based approaches）

高通量荧光显微镜可定量蛋白质亚细胞定位和自组装，但通常需阵列形式，难以扩展到数千个变体。VIS-seq将成像与原位测序结合，在细胞内以单细胞分辨率将表型与基因型连接，可用于数千个LMNA和PTEN变体的亚细胞定位定量。其缺点包括化学固定可能对动态凝聚体造成人工产物，以及图像处理计算需求高。CondenSeq是VIS-seq的简化版本，将大型设计的内在无序序列与绿色荧光蛋白（GFP）融合，通过自动显微镜定量细胞核内凝聚体形成，已用于约14,000个序列，可绘制序列组成和模式对核凝聚体形成的影响，但不提供材料性质、动力学或与内源性因子相互作用的信息。

### 体外选择平台（In vitro selection platforms）

体外平台可在精确控制条件下进行大规模测量，避免细胞适应性混杂因素。通过mRNA展示的凝聚体分配（CPmD）测定数十万种肽在生物分子凝聚体中的分配，通过测序量化肽在稀相与凝聚相之间的分配自由能，揭示序列长度、芳香族残基和精氨酸主导的凝聚语法，并发现疏水相互作用是凝聚体招募的主要决定因素；但该测量限于单一预定义凝聚体支架，且可能不反映全长蛋白质情境。另一种体外方法将应激诱导的蛋白聚集与多重质谱联用，通过TMT标记定量可溶部分，已用于超过18,000个小蛋白结构域的聚集倾向测定，发现疏水性和等电点与聚集相关但解释度有限，且含无序区的蛋白质更抵抗聚集。微流控平台也被用于体外自组装研究，如通过液滴包裹蛋白和硫黄素T（ThT）检测淀粉样成核，以及PhaseScan平台通过荧光标记蛋白在不同缓冲条件下构建定量相图，已用于FUS-G156E、G3BP1和NSP2等蛋白。

### 讨论（Discussion）

蛋白质序列与凝聚、聚集倾向和细胞功能之间的关系仍不完全清楚，尤其是在遗传变异背景下。可扩展实验方法已成为系统性解决这一挑战的有力工具，可并行测量数千个变体的凝聚和聚集表型，生成定量数据集，用于训练预测模型，并促进高通量发现调节分子。然而，许多检测依赖间接读数，可能需要通过可扩展的degron作图等方法解开自组装效应与蛋白质丰度效应。目前直接且特异地报告凝聚体形成并同时与聚集和