不同封口氧气渗透性下陈年红葡萄酒中缩合单宁演化标记的高级结构表征

《Current Research in Food Science》：Advanced structural characterization of condensed tannin evolution markers in long-aged red wines under different closure oxygen permeabilities

　　

摘要
理解葡萄酒中缩合单宁（CTs）的长期演化仍具挑战性，这是由于陈年葡萄酒的分子复杂性。在本研究中，研究人员首次将结合单宁组分分离、巯基酸解、UHPLC–UHRMS与AcquireX?数据依赖性采集以及基于t-SNE算法的特征分子网络（FBMN）的先进分析工作流程应用于葡萄酒。所研究的葡萄酒是陈年17年的正宗红葡萄酒。这一极为罕见的样本集，在四种不同氧气渗透性的封口下储存，为评估该工作流程在复杂葡萄酒基质中对缩合单宁演化标记进行深入结构表征的适用性提供了独特机会。采用该方法，共注释了139个CT演化标记。其中，122个标记被分配至2–3级，17个标记被分配至4级。总体而言，139个注释标记中有72个先前未被报道，包括2–3级组中的55个标记和3–4级组中的17个标记。这些标记源于单宁与花青素、吡喃花青素以及芳香醛之间的相互作用，氧化水平高达5级。探索性单变量（ANOVA）和多变量统计方法，包括主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA），揭示了在该特定样本集中标记丰度与封口氧气渗透性之间的相关趋势。总体而言，本研究证明了这种可转移的分析工作流程在来自陈年红葡萄酒的复杂基质中对缩合单宁演化标记进行全面结构表征的能力，并为其化学演化提供了新的分子见解。

论文解读文章

**研究背景与目的**

红葡萄酒在瓶陈过程中，其品质高度依赖于化学组成及其后续演化。酚类化合物，特别是缩合单宁（CTs），是决定陈年能力的关键成分。CTs由黄烷-3-醇单元（如儿茶素和表儿茶素）聚合而成，在陈年过程中通过氧化和非氧化反应发生广泛的结构修饰，参与与亚硫酸盐、花青素、吡喃花青素、香气化合物以及多糖、蛋白质等大分子的相互作用，从而调节酒体的涩味、苦味和颜色稳定性。尽管已有研究利用简化基质（如模型溶液或纯化葡萄籽提取物）表征了氧化标记，但将这些发现转移到真实葡萄酒基质中仍具挑战，CT在复杂葡萄酒中的分子表征仍不完整。这主要源于反应产物的极端多样性和复杂性、黄烷-3-醇单元的动态反应性、大量低丰度转化产物的存在，以及共洗脱和常规分析策略分辨能力与灵敏度的限制。本研究旨在首次将结合单宁组分分离、UHPLC–UHRMS与AcquireX?数据依赖性采集以及基于t-SNE算法的特征分子网络（FBMN）的先进分析工作流程应用于陈年红葡萄酒，以实现对CT演化标记的深入结构表征。

**研究内容与结论**

研究人员选取了陈年17年的正宗红葡萄酒（70%‘赤霞珠’和30%‘美乐’），这些酒在四种不同氧气渗透性的封口（合成塞、天然软木塞、微团聚软木塞DIAM A和DIAM B）下储存，为研究CT演化提供了独特机会。通过该工作流程，共注释了139个CT演化标记，其中72个为先前未报道的新标记。这些标记涉及单宁-单宁氧化产物、单宁-花青素缩合产物、单宁-吡喃花青素相互作用产物以及单宁-芳香醛相互作用产物，氧化水平最高达5级。探索性统计分析（ANOVA、PCA、HCA）揭示了在该特定样本集中标记丰度与封口氧气渗透性之间的相关趋势。本研究证明了该分析工作流程在复杂基质中对CT演化标记进行全面结构表征的能力，为葡萄酒老化化学提供了新的分子见解。论文发表在《Current Research in Food Science》。

**关键技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）使用Fractogel Toyopearl? HW-50F树脂进行固相萃取（SPE），分离单宁富集组分；（2）通过巯基酸解进行化学解聚；（3）采用UHPLC–UHRMS（Orbitrap Exploris 480）结合AcquireX?深度扫描工作流程进行数据依赖性采集；（4）利用MZmine和MetGem软件进行特征分子网络（FBMN）构建，并通过t-SNE算法进行可视化。样本队列来源于波尔多酒庄（Graves AOC）的17年陈年红葡萄酒，每种封口类型分析三个独立瓶作为生物学重复。

**研究结果**

**3.1. 17年陈年红葡萄酒中演化标记的表征**

**3.1.1. 单宁组分**：通过分离单宁组分，各样本浓度范围为2.25–2.72 g·L^-1，处于陈年红葡萄酒的典型范围（1.0–4.0 g·L^-1），表明该方法是有效的。

**3.1.2. UHPLC–MS/MS与分子网络**：AcquireX?工作流程相比标准DDA显著提高了MS/MS覆盖度，迭代过程中逐步排除高丰度离子，靶向低丰度特征。利用MS/MS数据构建的分子网络（MN）将921个节点中的636个连接成24个簇（余弦分数≥0.7），揭示了氧化相关特征根据化学相似性组织。t-SNE投影进一步将结构相关的特征分组。共注释了139个标记，分为四个分子家族。

**3.1.3. 化合物鉴定**：根据Schymanski置信水平，122个标记属于2–3级（可能结构或候选结构），17个标记属于4级（明确分子式）。具体包括：
- **单宁-单宁标记**：注释了12种已知氧化标记（M1–M12）和22种新氧化标记（M13–M34），其中新标记有13个达到2–3级，17个达到3–4级。这些标记主要为二聚体和三聚体，氧化水平从1到至少5，通过连续的质量差2.015 Da（脱氢）和特征碎片（RDA、BFF、HRF）进行鉴定。
- **单宁-花青素标记**：注释了11种已知的非氧化标记（M35–M45，包括T–A⁺和A–T型）和4种新氧化标记（M42–M45），以及12种已知的A–T型标记（M46–M59）和1种新氧化标记（M60）。这些标记涉及花青素与单宁单元的直接缩合或通过A型醚键连接，MS/MS特征包括葡萄糖损失（–162.052 Da）和RDA裂解。
- **单宁-吡喃花青素标记**：注释了18种标记（M61–M78），包括已知的吡喃花青素-单宁标记（如M61）和门桂素类标记（M68–M73），以及6种新氧化标记（M74–M78）。这些标记具有特征性的糖基损失（如葡萄糖、乙酰葡萄糖、对香豆酰葡萄糖），并通过BFF和RDA裂解进一步确认。
- **单宁-芳香醛相互作用标记**：注释了8种标记（M79–M86），包括松柏醛-单宁缩合物（M79–M83）和羟甲基糠醛-单宁缩合物（M84–M86）。其中M81b和M86a等标记的MS/MS显示亚硫酸盐加成物和特征性中性损失，表明这些反应涉及桶陈过程中产生的醛类。

**3.2. 根据封口类型比较单宁演化谱图**：探索性单变量ANOVA分析（p≤0.05）确定了212个显著变量，PCA和HCA分析显示四种封口类型存在分离。天然软木塞样本形成独立簇，合成塞样本独立聚类，DIAM A和DIAM B样本更接近。高氧气渗透性合成塞（OTR_T0=4.6 mg/年）与更氧化的单宁-单宁标记（如m/z 575.1178, 591.1128, 1221.1680）和吡喃花青素-单宁标记的较高丰度相关；低渗透性DIAM A塞（OTR_T17=0.22 mg/年）则与较不演化的结构（如m/z 577.1340, 579.1491）相关。单宁-花青素缩合产物未显示直接依赖封口氧气渗透性，表明其形成主要受内在老化反应驱动。单宁-芳香醛标记在较高渗透性封口下更丰富。这些趋势表明封口氧气渗透性可能影响单宁演化程度，但仅限于本研究的特定葡萄酒基质和陈年条件。

**总结讨论与结论**

本研究成功将结合单宁分离、化学解聚、UHPLC–UHRMS（AcquireX?）和特征分子网络的分析工作流程从葡萄籽提取物转移至陈年红葡萄酒，实现了对CT演化标记的全面结构表征。研究不仅揭示了已知和新标记，还阐明了它们之间的相互关系，推进了演化单宁的结构表征。结果表明，长期瓶陈导致CT通过缩合、氧化、聚合和结构重排发生广泛变化，包括高氧化水平的CT衍生物积累，这些在过去因分析限制而难以探索。研究结论部分指出：本研究证明了该分析工作流程在复杂基质中对缩合单宁演化标记进行全面结构表征的能力，并提供了新的分子见解。封口氧气渗透性可能影响单宁演化，但该效应具有基质特异性。这项工作为研究复杂食品系统中的多酚氧化提供了新平台，并显著增进了对葡萄酒陈酿化学的理解。