SORL1作为新型隐性复杂型遗传性痉挛性截瘫的推定候选基因：来自深度功能研究的见解

《Clinical and Translational Neuroscience》：SORL1 as a Putative Candidate Gene for a Novel Recessive Form of Complicated Hereditary Spastic Paraplegia: Insights from a Deep Functional Study

　　

引言：内体-溶酶体（endolysosome）和自噬（autophagy）通路中的基因是遗传性痉挛性截瘫（HSP）的主要贡献因素。HSP与阿尔茨海默病（AD）之间涉及巨自噬（macroautophagy）的致病联系已得到充分证实。分拣蛋白相关受体1（SORL1），一种内体运输蛋白，在谷氨酸能神经元稳态和白质束完整性中发挥关键作用。迄今为止，SORL1仅与显性AD和脑淀粉样血管病（CAA）相关。方法：研究人员对一例外显子组测序阴性的HSP伴脑视网膜血管病（CRV）病例进行了进一步的全基因组测序（whole-genome sequencing）。进行了RNA测序（RNA-seq）、蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光成像（immunofluorescence imaging），以探讨潜在的功能丧失（loss-of-function）机制。结果：测序揭示了一个双等位基因SORL1剪接供体位点变异（c.1211 + 1G > A）。转录组学证实了无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay）和异常剪接，预测了阅读框破坏。研究人员观察到患者来源的成纤维细胞中SORLA蛋白水平降低以及内体-溶酶体（endolysosomes）显著增大，进一步证实了该变异的致病性。结论：SORL1作为隐性致病基因的可能性得到以下数据的支持：SORL1基因组约束评分pRec = 1，该位点的高减数分裂重组率，Sorl1^?/?小鼠的表型类似HSP伴CRV，以及体外SORL1^?/?谷氨酸能神经元中的内体-溶酶体增大。综上所述，SORL1可能是复杂型HSP隐性形式的新候选基因。

**论文解读：SORL1作为新型隐性复杂型遗传性痉挛性截瘫的候选基因——来自深度功能研究的证据**

**研究背景与问题**

遗传性痉挛性截瘫（HSP）是一组以进行性下肢痉挛和无力为特征的孟德尔遗传病，患病率约为2–5/10万。HSP根据临床表现分为单纯型和复杂型，其致病基因已发现超过70个，其中约70个已明确。内体-溶酶体（endolysosome）和自噬（autophagy）通路是HSP发病的关键细胞机制之一，至少与24个HSP亚型相关。值得注意的是，HSP与阿尔茨海默病（AD）之间存在显著的表型重叠和共同的致病通路，如PSEN1、SPG11等基因同时参与两种疾病。分拣蛋白相关受体1（SORL1）编码的SORLA蛋白是内体-溶酶体通路的关键调控因子，参与淀粉样前体蛋白（APP）的分选和再循环，其功能丧失（LOF）与显性遗传的家族性AD及脑淀粉样血管病（CAA）明确相关。然而，SORL1是否以隐性遗传方式导致其他神经系统疾病，特别是HSP，此前未见报道。本研究旨在通过一例病因不明的复杂型HSP伴脑视网膜血管病（CRV）病例，探索SORL1双等位基因变异的致病性，并阐明其潜在机制。

**研究开展与结论**

研究人员对一名22岁男性先证者（近亲婚配后代）进行临床评估，其表现为进行性下肢痉挛性截瘫、眼底点状出血、生长迟缓及影像学上的多灶性白质高信号和钙化。经全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS，包括短读长和长读长）排除已知HSP、单基因干扰素病、脑小血管病等候选基因后，发现SORL1基因8号内含子存在一个纯合剪接供体位点变异（c.1211+1G>A）。通过RNA-seq、蛋白质印迹和患者成纤维细胞免疫荧光成像，研究人员证实该变异导致无义介导的mRNA降解（NMD）和异常剪接，预测产生截短蛋白；SORLA蛋白几乎完全缺失，早期内体和晚期内体/溶酶体显著增大。结合SORL1的基因组约束评分pRec=1（提示纯合LOF受强烈负选择）、该位点的高减数分裂重组率、Sorl1^?/?小鼠出现类似HSP伴CRV的表型，以及体外SORL1^?/?谷氨酸能神经元中内体-溶酶体增大等证据，研究人员得出结论：SORL1可能是复杂型HSP隐性遗传形式的候选致病基因。该研究发表于《Clinical and Translational Neuroscience》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用全基因组测序（包括短读长SRWGS和长读长LRWGS，样本来源为先证者及其无症状母亲）进行变异检测；通过RNA-seq（来自先证者、母亲及6名健康对照的外周血单个核细胞PBMCs，另纳入3例神经典型脑组织样本）分析剪接异常和差异表达；利用MAJIQ/VOILA量化局部剪接变异（LSV）；通过蛋白质印迹检测成纤维细胞中SORLA蛋白水平；使用共聚焦免疫荧光显微镜（标记EEA1和LAMP1）测量内体和溶酶体大小。此外，研究人员利用Allen Brain Atlas和NeMo分析平台获取人脑转录组数据，比较SORL1表达模式。

**研究结果**

**3.1 临床随访结果**
先证者接受抗痉挛药物和规律理疗，20个月随访显示症状稳定，仅跌倒频率轻微增加，影像学无变化，支持复杂型HSP的诊断。

**3.2 WES和WGS结果**
通过分层过滤（包括163个HSP基因、55个单基因干扰素病基因、1000余个颅内钙化/ALS/痉挛性共济失调等基因），未发现已知致病变异。长读长WGS（LRWGS）与短读长WGS（SRWGS）一致性>95%，但未检出非编码区致病变异、CNV、重复扩增或结构变异。最终唯一候选变异为SORL1基因8号内含子的纯合剪接供体位点变异c.1211+1G>A，在gnomAD v4.1中仅1例杂合携带（等位基因频率0.0000006203），且为LOF变异（ACMG/AMP标准：PM2、PVS1）。母亲为杂合携带者，父亲拒绝检测但LRWGS显示两个单倍型均携带该变异，证实父母各传递一个等位基因。SORL1的pRec=1、pLI=0、LOEUF=0.55，提示隐性遗传特征；纯合KO小鼠出现步态障碍和血管病变；该变异位于4.3 Mb（WES）或0.9 Mb（LRWGS）的纯合性缺失区域，进一步支持隐性遗传模式。

**3.3 异常RNA表型**
RNA-seq显示先证者SORL1转录本显著下调（log2FC = -1.218至-1.66，padj < 0.005），证实NMD导致约61%的转录本降解。利用MAJIQ/VOILA分析，发现先证者存在6种局部剪接变异（LSV1-6）：LSV1完全缺失正常剪接；LSV2和LSV3激活两个5′隐蔽剪接位点；LSV6显示内含子8保留增加；LSV4和LSV5分别导致外显子7-8跳跃或外显子8跳跃。所有LSV均导致阅读框移码并引入提前终止密码子（PTC），预测产生<410个氨基酸的截短蛋白（正常SORLA约2200个氨基酸）。

**3.4 差异表达基因（DEG）功能分析**
16个显著DEG（log2FC±1，padj<0.05）的过表达分析显示，Tau蛋白激酶活性调控（GO:1902947）显著富集（p=0.000007，FDR=0.03），提示SORL1下调可能影响磷酸化tau蛋白的亚细胞分布。网络拓扑分析进一步支持该结果。未发现干扰素刺激基因或颅内钙化相关基因的异常表达。

**3.5 蛋白质印迹和免疫荧光分析**
蛋白质印迹显示先证者PBMCs中几乎检测不到全长SORLA蛋白，而GAPDH正常。患者成纤维细胞中，EEA1阳性早期内体面积显著大于对照（0.44±0.03 μm² vs 0.27±0.01 μm²，p=2.03×10^-5），LAMP1阳性晚期内体/溶酶体面积也显著增大（0.53±0.01 μm² vs 0.24±0.01 μm²，p=8.55×10^-20），与SORL1纯合KO hiPSC来源神经元的研究结果一致，首次在患者成纤维细胞中证实该细胞表型。

**讨论与结论**

**讨论部分总结**
研究人员首先排除了其他已知病因（如感染、自身免疫、单基因干扰素病、钙稳态障碍、脑小血管病等），并指出先证者临床表现与SORL1纯合LOF相关。综合三条证据支持SORL1的隐性遗传可能性：①pRec=1表明纯合LOF受强烈负选择，gnomAD中无纯合LOF；②Sorl1^?/?小鼠表现出步态障碍和视网膜异常，而杂合KO仅轻微生化改变；③SORL1所在区域重组率高（1.4–1.8 cM/Mb），外显子8的pext评分高（0.8–0.9），表明其功能重要。该变异导致NMD和异常剪接，产生截短蛋白，并引起内体-溶酶体增大，与APP过量产生Aβ40/42导致内体淤滞的机制一致。研究人员还发现SORL1在M1皮层锥体神经元中高表达，且其表达模式与年龄相关，先证者发病年龄（22岁）恰逢SORL1表达峰值，提示因果关联。此外，SORL1还参与谷氨酸受体（GLUA1）再循环和白质束微结构完整性维持。最后，通过Genematcher平台找到另一例SORL1与HSP匹配的病例，以及一例复杂型隐性早发性痴呆匹配，进一步支持结论。

**研究结论部分翻译**
SORL1作为隐性遗传致病基因的可能性得到以下数据的支持：SORL1基因组约束评分pRec=1，该位点的高减数分裂重组率，Sorl1^?/?小鼠的表型类似HSP伴CRV，以及体外SORL1^?/?谷氨酸能神经元中的内体-溶酶体增大。综上所述，SORL1可能是复杂型HSP隐性形式的新候选基因。研究人员建议在所有已建立基因检测阴性的HSP病例中排查SORL1双等位基因致病性变异，未来类似研究将有助于验证该发现并确立SORL1作为该表型的真正隐性致病基因。