《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Investigation of the Nrf2-Keap1 signaling pathway's response to oxidative stress in
Meretrix meretrix
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摘要：Keap1-Nrf2信号通路主要调控细胞对氧化应激和亲电应激的保护性反应。该通路涉及两个关键蛋白：核因子E2相关因子2（Nrf2），它是细胞防御的关键调节因子；以及Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1），一种抑制蛋白。Keap1与Nrf2相互作用，通
摘要：Keap1-Nrf2信号通路主要调控细胞对氧化应激和亲电应激的保护性反应。该通路涉及两个关键蛋白：核因子E2相关因子2（Nrf2），它是细胞防御的关键调节因子；以及Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1），一种抑制蛋白。Keap1与Nrf2相互作用，通过泛素-蛋白酶体途径导致Nrf2降解。在本研究中，研究人员从梅文蛤（*Meretrix meretrix*）中克隆了这些蛋白，获得了长度为2172 bp和1791 bp的全长cDNA序列。序列比对和系统发育分析显示，Nrf2和Keap1在软体动物物种中高度保守，但在*M. meretrix*中具有独特性。MmNrf2和MmKeap1在多个组织中均有表达，分别在消化腺和鳃中表达量最高。研究人员进行了RNA干扰实验，分析了Keap1-Nrf2信号通路关键基因（Nrf2、Keap1、Maf、p62）、外源物代谢基因（CYP3A3和Pgp）以及抗氧化和解毒基因（SOD、NQO1、CAT和GCLM）的mRNA转录谱。研究人员还测定了暴露于10 μg/L苯并[a]芘（BaP）6小时后消化腺中的ROS、T-AOC、丙二醛（MDA）和GSH水平。结果显示，MmNrf2 mRNA水平下降了60.95%。Keap1-Nrf2信号通路的变化以及BaP诱导的氧化应激基因表达与MmNrf2的变化一致，表明其在激活抗氧化和解毒基因中发挥重要作用。此外，10 μg/L BaP暴露后，消化腺中的ROS、T-AOC和GSH水平显著升高，但在siNrf2注射后6小时下降。研究人员还使用实时PCR评估了10 μM萝卜硫素（Sulforaphane）对暴露于1 μg/L BaP 24小时的*M. meretrix*中Keap1-Nrf2信号通路和BaP诱导的氧化应激指标的影响。与单独BaP处理相比，10 μM SFN和1 μg/L BaP联合暴露导致ROS水平降低，而T-AOC和GSH水平显著升高；所有基因在24小时后均表现出诱导表达，但在加入10 μM SFN后略有下降。总之，这些数据表明，MmNrf2响应氧化应激因子，调控Keap1-Nrf2信号通路，并在调节双壳软体动物抗氧化酶基因表达中发挥关键作用。
论文解读：Nrf2-Keap1信号通路在梅文蛤氧化应激响应中的功能研究
一、研究背景与目的
核因子E2相关因子2（Nrf2）与Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）构成的信号通路是细胞抵御氧化应激和亲电应激的核心防御机制。在正常生理条件下，Nrf2与Keap1结合，通过Cullin-3型E3泛素连接酶复合体介导的泛素-蛋白酶体途径被快速降解，从而维持细胞内氧化还原稳态。当外源污染物如苯并[a]芘（BaP）经I相酶代谢后，会产生大量活性氧（ROS）和活性代谢产物，这些氧化信号修饰Keap1上的关键半胱氨酸残基，导致Nrf2释放并转位至细胞核，结合抗氧化反应元件（ARE），启动II相解毒酶和抗氧化酶基因的转录。目前，该通路在哺乳动物中的调控机制已较为明确，但在软体动物中的功能验证仍主要停留在基因转录表达水平。梅文蛤（*Meretrix meretrix*）是中国重要的经济贝类，常受到近岸水域多环芳烃污染。本研究旨在以BaP为诱导物建立氧化应激模型，通过分子生物学技术和药理学干预，从正反两个方向探究梅文蛤Nrf2-Keap1信号通路在氧化应激下的动态响应、关键作用及分子机制，为揭示该通路在贝类抗氧化防御中的保守功能提供实验证据。
二、主要技术方法
研究人员从梅文蛤转录组文库中鉴定并克隆了Nrf2和Keap1基因的全长编码区序列，通过序列比对、结构域预测和系统发育分析明确其分子特征。利用实时荧光定量PCR检测基因的组织表达分布。采用RNA干扰技术合成Nrf2特异性siRNA，通过体内注射建立Nrf2敲低模型，并结合BaP暴露进行双因素实验。分离培养梅文蛤消化腺原代细胞，使用Nrf2激活剂萝卜硫素（SFN）进行体外干预实验。通过荧光探针检测ROS水平，利用生化试剂盒测定总抗氧化能力（T-AOC）、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量，同时检测信号通路及下游抗氧化、解毒相关基因的mRNA转录水平。实验用梅文蛤采集自中国连云港海头码头。
三、研究结果
3.1 MmNrf2和MmKeap1的分子特征
克隆获得梅文蛤Nrf2基因（命名为MmNrf2，GenBank登录号PV761049）全长CDS为2172 bp，编码724个氨基酸，理论等电点4.97，分子量81.11 kDa；Keap1基因（命名为MmKeap1，GenBank登录号PV761048）全长CDS为1791 bp，编码597个氨基酸，理论等电点6.21，分子量67.07 kDa。MmNrf2 N端含有高度保守的DLGex基序和ETGE基序；MmKeap1包含一个BTB结构域、一个BACK结构域和六个Kelch重复序列。系统发育分析表明，软体动物Nrf2和Keap1序列高度保守，且梅文蛤与菲律宾蛤仔的亲缘关系最近。
3.2 MmNrf2和MmKeap1的组织表达分布
MmNrf2和MmKeap1在鳃、消化腺、闭壳肌、足和外套膜中均有表达。MmNrf2在鳃中表达量最高；MmKeap1在鳃和消化腺中的表达量分别比外套膜高13.91倍和10.22倍。这种组织分布模式与鳃和消化腺分别作为直接环境暴露屏障和主要代谢解毒器官的生理功能相适应。
3.3 MmNrf2敲低对BaP诱导氧化应激的影响
体内RNA干扰实验结果显示，siNrf2注射使MmNrf2 mRNA水平显著下降60.95%。单独BaP暴露显著升高ROS、T-AOC和GSH水平，并诱导MmNrf2、MmMaf、MmCYP3A3、MmSOD、MmNQO1、MmCAT和MmGCLM等基因的转录表达。而siNrf2与BaP联合处理时，BaP引起的通路基因和抗氧化基因上调被显著抑制，ROS水平进一步升高，T-AOC和GSH的上升幅度减弱，MDA含量出现明显诱导，表明Nrf2敲低破坏了机体的氧化还原补偿能力，加剧了BaP诱导的脂质过氧化损伤。
3.4 SFN激活Nrf2-Keap1通路对BaP诱导氧化损伤的缓解效应
体外原代细胞实验中，10 μM SFN单独处理显著降低基础ROS水平，并诱导MmKeap1、MmNQO1和MmCAT等基因表达。1 μg/L BaP单独暴露导致ROS和MDA显著升高，并上调MmMaf、Mmp62、MmCYP3A3、MmSOD、MmNQO1、MmCAT和MmGCLM的表达。SFN与BaP联合暴露时，与BaP单独处理相比ROS水平显著降低，而T-AOC和GSH水平显著升高，且通路中所有检测基因均表现出诱导表达。这表明SFN通过激活Nrf2-Keap1信号通路部分缓解了BaP诱导的氧化应激，但并未完全逆转其毒性效应。
四、讨论与结论
讨论部分指出，MmNrf2和MmKeap1在鳃和消化腺的高表达反映了这些高能量、高应激组织需要更强的抗氧化保护。体内Nrf2敲低实验证实，当Nrf2表达受抑制时，BaP诱导的抗氧化基因上调被削弱，T-AOC和GSH上升受阻，ROS和MDA积累，说明完整的Nrf2-Keap1通路是梅文蛤有效应对BaP氧化应激所必需的。SFN激活实验则从正向证实，激活该通路可增强细胞抗氧化能力，减轻BaP引起的氧化损伤。此外，SFN单独处理诱导MmKeap1表达，提示该通路存在负反馈调节机制，防止Nrf2过度激活。Mmp62的上调可能形成正反馈回路，维持Nrf2转录水平。研究结论认为，克隆的MmNrf2和MmKeap1在软体动物中高度保守并广泛表达；MmNrf2敲低显著抑制BaP诱导的抗氧化和解毒基因转录上调，并改变生化抗氧化指标；SFN暴露激活通路组分转录。综合转录数据表明，MmNrf2可能作为双壳贝类Nrf2-Keap1通路中的关键转录调控因子，其功能与不同物种中Nrf2同源物的保守抗氧化和解毒调节作用一致。该研究为理解海洋双壳贝类应对多环芳烃污染的分子防御机制提供了重要实验依据，也为贝类环境毒理学评价和养殖保护提供了潜在生物标志物参考。
