孕早期全氟及多氟烷基物质对胎盘功能及母胎免疫交互作用的损伤

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Impairment of placental function and maternal-fetal immunity cross-talk by per- and polyfluoroalkyl substances during early pregnancy

　　

全氟及多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances, PFAS）是持续存在的环境污染物，与不良妊娠结局及免疫功能障碍相关。然而，PFAS对母胎界面滋养层介导的免疫交互作用的影响尚不明确。本研究采用三维（three-dimensional, 3D）滋养层球体模型及与CD4+ T细胞的共培养体系，评估了人体相关浓度PFAS对滋养层功能及免疫交互的影响。研究人员将JEG-3球体暴露于多种PFAS，包括全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate, PFOS）、全氟辛酸（perfluorooctanoic acid, PFOA）、全氟己烷磺酸（perfluorohexane sulfonate, PFHxS）、全氟壬酸（perfluorononanoic acid, PFNA）、全氟癸酸（perfluorodecanoic acid, PFDA）及全氟十一酸（perfluoroundecanoic acid, PFUnDA），以单化合物及混合物形式、在真实环境浓度下评估细胞活力、侵袭能力及滋养层来源的β-人绒毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin, β-hCG）分泌水平。研究人员利用胎盘-免疫细胞共培养模型，检测了双向交互作用及其对两种细胞区室功能终点的影响，并进一步探讨了PFAS暴露可能干扰这一双向通讯的机制。研究发现，暴露于PFOS、PFOA及PFAS混合物后，滋养层细胞活力显著降低。PFAS混合物、PFOS、PFHxS、PFNA及PFDA暴露显著增加JEG-3球体的侵袭能力，而PFOA则显著降低JEG-3侵袭力。此外，PFOS及PFAS混合物暴露48小时后，JEG-3球体的β-hCG分泌量下降。进一步研究表明，PFAS混合物暴露后，CD4+ T细胞中CD69及干扰素γ（interferon-γ, IFNγ）的表达下调，尤其在Th2细胞亚群中较为显著，同时CD154表达亦降低。综上所述，这些研究结果表明，PFAS暴露可能影响滋养层介导的免疫信号传递，对妊娠相关过程具有潜在影响。

论文解读：全氟及多氟烷基物质对胎盘功能与母胎界面免疫交互的损伤效应

一、研究背景与问题提出

胎盘是妊娠期间形成的重要临时性器官，在母胎界面承担内分泌、物质转运及免疫调节等多项关键功能，对胎儿发育至关重要。滋养层细胞是胎盘的主要功能细胞，其增殖、分化和侵袭行为受到严格调控：滋养层向母体蜕膜的侵袭及螺旋动脉重塑是建立充足母体血供的前提，合体滋养层则负责营养和气体交换并分泌妊娠关键激素，如β-人绒毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin, β-hCG）。同时，滋养层主动参与母胎界面免疫耐受的建立，通过与母体免疫细胞相互作用调节局部免疫微环境。上述过程中任一环节的紊乱均可能损害胎盘功能，导致胎儿生长受限（fetal growth restriction, FGR）、子痫前期、自发性早产及死产等不良妊娠结局。

正常妊娠的维持依赖于母体对半异基因胎儿精细调控的免疫耐受，该耐受在胚胎着床期间即已建立。CD4+ T细胞作为适应性免疫系统的关键调控者，在协调免疫激活与抑制中发挥核心作用。滋养层通过免疫教育作用塑造CD4+ T细胞的分化、活化及细胞因子分泌谱，促进免疫耐受表型的建立，包括将Th1/Th17型反应向Th2型偏移，从而营造抗炎和耐受性微环境。然而，这些精密调控的过程可能易受环境污染物干扰，进而危及母胎界面的免疫稳态。

全氟及多氟烷基物质（per- and polyfluoroalkyl substances, PFAS）是一类广泛存在于环境和人体血液中的持久性有机污染物。毒理学与流行病学研究表明，PFAS暴露可能干扰胎盘发育相关的生物学过程，包括抑制滋养层侵袭、干扰趋化因子信号、改变增殖与凋亡平衡、损害滋养层分化等。已有研究报道PFAS可改变免疫细胞尤其是T细胞亚群的组成、调节细胞因子分泌、影响免疫细胞发育与功能。但以下关键科学问题仍待回答：其一，PFAS如何影响滋养层与CD4+ T细胞之间的双向交互作用？其二，与人体真实暴露浓度相一致的PFAS混合物是否产生与单一化合物不同的效应？其三，生理相关的三维（three-dimensional, 3D）滋养层模型能否更好地揭示PFAS的毒性效应？基于上述空白，研究人员提出如下假说：PFAS暴露可破坏滋养层球体功能，并损害滋养层介导的CD4+ T细胞免疫教育作用。

二、研究内容与主要结论

该论文发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。研究采用人JEG-3绒毛膜癌细胞系构建3D滋养层球体模型，以更真实地模拟体内滋养层的形态和功能特性。研究设置了PFHxS、PFOS、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA六种PFAS单化合物及混合物暴露组，浓度梯度基于斯堪的纳维亚人群血液中检出的真实浓度水平（X0.5至X1000倍），并以0.5% DMSO作为溶剂对照。研究人员系统评估了多种功能终点：采用多染料活细胞染色评估球体活力；采用Matrigel基质胶侵袭实验动态监测96小时内球体侵袭面积变化；采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量培养上清液中β-hCG分泌水平。在此基础上，研究人员进一步建立了JEG-3球体与CD4+ T细胞的共培养体系——从莱比锡大学血库获取5名20-35岁健康女性供体外周血，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），通过磁激活细胞分选阴性选择纯化CD4+ T细胞，以每个球体2000个CD4+ T细胞的比例共培养48小时，运用光谱流式细胞术对T细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Treg）及活化标志物（CD69、CD154）和细胞因子（肿瘤坏死因子-α TNFα、干扰素-γ IFNγ）进行免疫表型分析。

三、研究结果

3.1 PFAS对JEG-3球体活力的差异性剂量-效应

通过多染料活细胞染色结合Calcein AM荧光强度定量分析发现，PFOS暴露呈现非单调剂量-效应关系，在X10浓度下活力显著降低；而PFOA和PFAS混合物暴露则呈剂量依赖性降低球体活力，分别在X1和X10浓度即达到统计学显著。其余四种PFAS单化合物在测试条件下未对球体活力产生显著影响。该结果揭示不同PFAS化合物对滋养层活力具有不同的毒性特征。

3.2 PFAS暴露失调JEG-3球体的侵袭能力

在Matrigel基质胶中监测球体96小时侵袭过程，结果显示：在72小时时间点，PFOS和PFUnDA暴露组的侵袭率已显著高于对照组；至96小时，PFHxS、PFNA及PFAS混合物也表现出显著增强的侵袭能力。相反，PFOA暴露则显著抑制滋养层球体的侵袭能力，该抑制作用在72小时即可观察到并持续至96小时。研究过程中早期时间点（24、48小时）各处理组间的侵袭率差异较小且未达统计学显著。上述结果表明PFAS对滋养层侵袭功能具有化合物特异性的失调作用。

3.3 PFAS混合物减少JEG-3球体β-hCG分泌

ELISA检测显示，PFHxS、PFOA、PFNA、PFDA及PFUnDA单化合物暴露48小时后对β-hCG分泌无显著影响。PFOS在X1000浓度及PFAS混合物在X100和X1000浓度下均导致β-hCG分泌显著减少。在较低混合物浓度（X0.5-X10）下虽未达到统计学显著差异，但观察到β-hCG分泌下降的一致性趋势。

3.4 PFAS混合物对共培养体系中CD4+ T细胞亚群比例无显著影响

流式细胞术分析显示，PFAS混合物暴露48小时后，总CD4+ T细胞比例及各亚群（Th1、Th2、Th17、Treg细胞）比例与DMSO对照组相比均无统计学显著差异。然而，Treg细胞群随PFAS暴露浓度升高呈现下降趋势，尽管该趋势未达到统计显著性。

3.5 PFAS混合物抑制共培养体系中CD4+ T细胞活化状态及Th2细胞功能

在共培养体系中，PFAS混合物暴露显著改变了CD4+ T细胞的活化状态。具体表现为：X1000浓度下CD69表达显著下降；X100浓度下CD154表达显著降低；X1、X10、X100及X1000浓度下IFNγ表达均显著降低。亚群分析进一步显示，Th2细胞在最高浓度PFAS混合物暴露下CD69表达显著降低，在X1和X100浓度下IFNγ表达亦显著减少。而Th1和Th17亚群中的活化标志物表达未观察到显著变化。值得注意的是，虽然IFNγ并非经典的Th2型细胞因子，但其减少可能反映了Th2细胞功能可塑性的损伤。

四、讨论与结论

本研究表明，PFAS单化合物及其混合物对滋养层功能产生多方面干扰效应，包括活力改变、侵袭能力失调和内分泌功能受损，但不同化合物表现出各自独特的毒性特征。PFOA在较低浓度即可降低细胞活力并抑制侵袭，却不影响β-hCG分泌；PFOS和PFAS混合物则表现为活力降低伴随侵袭增强和β-hCG分泌减少。该类功能变化并非单纯细胞毒性的体现，而是表明PFAS可能通过不同信号通路差异性调控滋养层行为，其中PFAS混合物对β-hCG的抑制尤为值得关注，因为hCG已被证实可调节T细胞功能、维持母胎界面免疫耐受，其分泌减少可能干扰hCG驱动的母体免疫调空机制。

共培养实验表明，PFAS混合物暴露抑制CD4+ T细胞的活化状态并损害其效应功能，且该效应在Th2细胞中最为显著。鉴于CD4+ T细胞调控对母胎免疫稳态的关键作用，其功能紊乱与复发性妊娠丢失和子痫前期等不良妊娠结局相关。但该抑制作用是否代表生理性耐受偏移，仍需进一步探究。研究人员同时指出，PFAS混合物所诱导的T细胞反应既可能是通过改变滋养层内分泌功能间接实现，也可能源于PFAS对T细胞的直接作用。

本研究还揭示了PFAS混合物效应的非加和性特征——单一化合物的效应无法预测混合物的综合效应，这提示在真实环境暴露情境下，对PFAS复合暴露的评估较单一化合物更具现实意义。研究存在一定局限性：含血清培养基中PFAS的蛋白结合可能降低其生物利用度，但该条件更贴近体内广泛蛋白结合的生理状态；常规胎牛血清而非DCC处理血清中内源性激素的潜在影响无法完全排除；分子机制层面的深入解析仍有待开展。

综上所述，研究人员得出结论：在体外实验条件下，PFAS单化合物及其混合物对胎盘功能具有不利影响，并可调节母胎界面免疫交互作用。该研究强调了采用生理相关模型系统评估化学物质在孕早期毒性效应的重要性，提示在评价PFAS生物学效应时，应同时关注滋养层功能和免疫交互两方面指标，尤其是在更贴近复杂环境暴露的条件下。