《Bacteria》：Exploratory Assessment of Oral Microbiome Dysbiosis Associated with Chronic Smokeless Tobacco Use: A Sibling-Based Study
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无烟烟草（SLT）消费是南亚国家（包括印度）口腔失调和口腔癌的重要风险因素。然而，其对口腔微生物生态学、功能重组和性别特异性微生物反应的影响仍不清楚。本研究旨在利用受控的基于同胞的混合时间代表性框架，评估不同受试者组（成瘾男性/AM、成瘾女性/AF、非成瘾男性
无烟烟草（SLT）消费是南亚国家（包括印度）口腔失调和口腔癌的重要风险因素。然而，其对口腔微生物生态学、功能重组和性别特异性微生物反应的影响仍不清楚。本研究旨在利用受控的基于同胞的混合时间代表性框架，评估不同受试者组（成瘾男性/AM、成瘾女性/AF、非成瘾男性/NAM和非成瘾女性/NAF）中烟草相关的口腔微生物组失调。为减少短期时间变异并生成代表性口腔微生物组图谱，研究人员每日收集口腔漱口液样本，连续七天，并在DNA提取和16S rRNA基因测序前对每个研究组内的样本进行混合。变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）是所有样本中的优势菌门。成瘾用户显示出更高的厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes）比值、更少的可培养物种和更多的病原共生菌，同时烟草成瘾组的香农（Shannon）多样性较低，且成瘾与非成瘾样本之间β多样性部分分离。链球菌属（Streptococcus）、戈登氏菌属（Gemella）、奈瑟氏菌属（Neisseria）、韦荣氏球菌属（Veillonella）、不动杆菌属（Acinetobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）在烟草相关微生物组中富集，而丛毛单胞菌属（Comamonas）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、德夫特氏菌属（Delftia）、黄杆菌属（Flavobacterium）及相关分类单元在非成瘾个体中富集，这些结果在差异丰度分析、STAMP和SIMPER三种分析中均获得一致识别。研究人员观察到共享的核心口腔微生物组和独特的“烟草相关”微生物特征。口腔生态型（Orotype）映射显示，微生物群落向链球菌属主导（S型）失调状态的转变由烟草成瘾驱动，并引入了一个新的概念框架——烟草相关失调指数（TDI），该指数在成瘾参与者中表现出更高值。此外，功能预测分析揭示了氨氧化、脱卤、硫酸盐还原、亚硝酸盐还原、几丁质降解和异源生物代谢途径的富集增强，突显了微生物对解毒的适应性。总之，慢性无烟烟草暴露与生态失衡、病原共生菌富集、微生物多样性丧失、功能失调和代谢重编程相关，提示了可能与慢性炎症和口腔癌发生相关的描述性生态模式。
**研究背景与问题**
人类口腔微生物组（oral microbiome）包含超过700种微生物物种，在维持口腔健康中发挥关键作用。然而，无烟烟草（SLT）消费是南亚地区（包括印度）口腔失调（oral dysbiosis）和口腔癌的重要风险因素。尽管吸烟对口腔微生物组的影响已有较多研究，但无烟烟草对口腔微生物生态、功能重组及性别特异性微生物反应的影响仍不清楚。现有研究提示，烟草成分（如尼古丁、亚硝胺）可改变口腔pH、氧水平和免疫功能，导致机会性病原体增殖和共生菌耗竭，但缺乏基于受控家庭环境和纵向采样设计的系统评估。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过受控的基于同胞的采样框架，评估慢性无烟烟草使用相关的口腔微生物组失调、生态型转变、功能代谢漂移，并引入新的概念框架——烟草相关失调指数（TDI）。该论文发表在《Bacteria》。
**关键技术与方法**
研究人员采用基于同胞的配对设计，纳入4名健康个体（每亚组n=1：成瘾男性/AM、成瘾女性/AF、非成瘾男性/NAM、非成瘾女性/NAF），成瘾组与对应非成瘾组为同胞，且来自同一家庭。为减少短期时间变异，每日收集口腔漱口液样本（未刺激口腔漱口液），连续7天，并在DNA提取前对每个亚组内样本进行混合，以获得代表性口腔微生物组图谱。使用HiPurA
TM Water DNA Purification Kit提取DNA，扩增16S rRNA基因V3-V4区域，在Illumina MiSeq平台进行双端测序（2×300 bp）。原始序列经FastQC质控、Trimmomatic修剪、PEAR合并后，使用Kraken2和Bracken进行物种分类及丰度估计。α多样性通过香农指数（Shannon index）评估，β多样性基于Bray-Curtis相异度进行主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）。差异丰度分析采用log2倍数变化，并应用STAMP（Statistical Analysis of Metagenomic Profiles）和SIMPER（Similarity Percentage）进行物种级比较。此外，基于分类丰度谱，使用METAGENassist平台进行表型功能预测分析。样本来源为印度家庭，参与者均无近期抗生素使用史和慢性疾病。
**研究结果**
**3.1 样本元数据、pH、浊度和总活菌计数分析**：
成瘾参与者（AM和AF）的口腔漱口液样本pH更偏酸性，非成瘾组（NAM和NAF）pH较高。总活菌计数（TVC）显示，非成瘾组可培养微生物计数较高，成瘾组较低，提示烟草使用改变了口腔微生物生态平衡。
**3.2 测序数据总结**：
所有样本均获得高质量测序读数，经修剪后AF、AM、NAF和NAM的读数分别为49,735、62,111、1,509,493和94,619。大部分读数Phred质量评分超过Q30，确保了下游分析的可靠性。
**3.3 分类组成**：
门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为优势菌门。成瘾组（AF和AM）的厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值较高（AF: 3.5, AM: 6.27），非成瘾组（NAF: 0.32, NAM: 0.7）比值较低且较平衡。属水平上，成瘾样本中假单胞菌属（Pseudomonas）、链球菌属（Streptococcus）等富集；非成瘾样本中丛毛单胞菌属（Comamonas）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）等分布更均匀。种水平上，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）等在高丰度。
**3.4 α多样性**：
香农多样性指数显示，非成瘾组（NAF和NAM，约3.0-3.3）显著高于成瘾组（AF和AM，约1.6-2.2），表明烟草使用降低了微生物丰富度和均匀度。Wilcoxon秩和检验无统计学显著性（W=4, p=0.333），但趋势明显。
**3.5 β多样性**：
基于Bray-Curtis相异度的PCoA显示，成瘾样本（AF和AM）与非成瘾样本（NAF和NAM）在排序空间中部分分离。PERMANOVA分析显示烟草暴露效应大小R2=0.415，但p=0.333，不具统计学显著性，提示趋势需更大样本验证。
**3.6 差异丰度分析**：
log2倍数变化显示，成瘾组中戈登氏菌属（Gemella）、链球菌属（Streptococcus）、奈瑟氏菌属（Neisseria）、肠杆菌属（Enterobacter）、希瓦氏菌属（Shewanella）、不动杆菌属（Acinetobacter）和韦荣氏球菌属（Veillonella）富集；非成瘾组中黄杆菌属（Flavobacterium）、弓形菌属（Arcobacter）、德夫特氏菌属（Delftia）、脱氯单胞菌属（Dechloromonas）、固氮螺菌属（Azospira）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）和Jejubacter富集。
**3.7 基于STAMP的物种级比较分析**：
成瘾男性（AM）中，约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）、琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）、洛氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）、Gemella sp. oral taxon 928、干燥奈瑟氏菌（Neisseria sicca）、小韦荣氏球菌（Veillonella parvula）和产黑色素普雷沃氏菌（Prevotella melaninogenica）高丰度，提示促炎和生物膜形成的失调环境。成瘾女性（AF）中，假单胞菌属（Pseudomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、奈瑟氏菌属（Neisseria）和韦荣氏球菌属（Veillonella）显著富集。非成瘾组则富含共生和环境相关菌种。
**3.8 SIMPER/生物标志物候选分析**：
SIMPER分析显示，假单胞菌属（Pseudomonas）、链球菌属（Streptococcus）和不动杆菌属（Acinetobacter）对两组间群落差异贡献最大，其次为沙门氏菌属（Salmonella）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、气单胞菌属（Aeromonas）和肠杆菌属（Enterobacter）。
**3.9 核心和独特分类单元**：
UpSet图分析显示，所有样本共享247个分类单元，构成核心口腔微生物组。非成瘾样本（尤其NAF）拥有更多独特分类单元，而成瘾样本独特分类单元减少，提示烟草使用导致微生物多样性降低和群落均质化。
**3.10 烟草相关失调指数分析**：
TDI值在成瘾男性（AM: 0.8620）和成瘾女性（AF: 0.8231）中显著高于非成瘾女性（NAF: 0.1037）和非成瘾男性（NAM: 0.0466），表明成瘾组存在明显的病原共生菌富集和共生菌耗竭驱动的生态失衡。
**3.11 口腔生态型组成重组与链球菌主导的S型失调**：
归一化生态型组成显示，成瘾组（AM和AF）中链球菌属（Streptococcus）占比极高（85.53%和77.20%），呈现S型主导状态；非成瘾组（NAM和NAF）则链球菌属与普雷沃氏菌属（Prevotella）比例较均衡，且NAF中奈瑟氏菌属（Neisseria）丰度较高。三元生态型映射显示，成瘾样本位于S型失调生态空间，非成瘾样本位于过渡或平衡空间。
**3.12 基于表型的功能和代谢预测分析**：
在成瘾男性（AM）中，预测的氨氧化、亚硝酸盐还原、硫酸盐还原、硫氧化、几丁质降解、木聚糖降解、芳香烃降解和氯酚降解等功能类别相对丰度较非成瘾男性（NAM）降低；而脱卤、阿特拉津代谢等功能类别富集。在成瘾女性（AF）中，阿特拉津代谢、几丁质降解、亚硝酸盐还原、脱卤、硫酸盐还原和氨氧化等功能显著富集，而硫化物氧化、硫氧化、木聚糖降解、固氮、氯酚降解等功能减少。总体表明，烟草暴露驱动口腔微生物组从营养循环向解毒和化学应激适应方向的功能漂移。
**讨论与结论**
研究人员讨论指出，慢性无烟烟草使用与口腔微生物组生态失衡、病原共生菌富集、多样性丧失、功能失调和代谢重编程相关。成瘾组中F/B比值升高、香农多样性降低、β多样性部分分离，以及TDI值升高，共同支持烟草诱导的生态失调。性别特异性分析显示，成瘾男性以链球菌属（Streptococcus）、戈登氏菌属（Gemella）、不动杆菌属（Acinetobacter）等富集为特征，成瘾女性则以假单胞菌属（Pseudomonas）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）为主，提示不同性别的微生物重组模式。生态型从平衡状态向S型链球菌主导失调状态转变，反映了酸性和生物膜形成的生态压力。功能预测分析表明，烟草暴露导致解毒相关途径（如脱卤、亚硝酸盐还原、硫酸盐还原）富集，而营养循环途径（如氮循环、硫氧化）减少，提示微生物组向应激适应和解毒方向的功能特化。研究人员提出TDI作为初步生态指数，整合病原共生菌富集与共生菌耗竭，以描述烟草相关口腔失调。研究结论强调：慢性无烟烟草暴露与生态失衡、病原共生菌富集、微生物多样性丧失、功能失调和代谢重编程相关，这些描述性生态模式可能与慢性炎症和口腔癌发生相关。由于样本量小，结果需在更大独立队列中验证。研究局限性包括单一样本、物种级鉴定受短读长限制、测序深度差异引入偏倚等。结论部分翻译如下：
**结论**：本研究利用受控的家庭同胞配对框架，提供了慢性无烟烟草（SLT）使用如何改变口腔微环境的近距离观察。通过7天混合样本以消除每日背景噪声，研究人员捕获了每位参与者口腔生态系统的稳定描述性快照。研究结果在成瘾组中呈现出清晰模式：更高的厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes）比值、微生物多样性整体下降，以及机会性病原共生菌（如链球菌属（Streptococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）和韦荣氏球菌属（Veillonella））的显著增加。生态学上，数据显示从健康平衡状态向耐酸、生物膜形成且链球菌属主导（S型）设置的明确转变。为追踪这些变化，研究人员引入了烟草相关失调指数（TDI）作为新的概念工具；该指数成功平衡了病原共生菌生长与共生菌损失，显示出烟草用户与其非用户同胞之间失调评分的明显差距。所提出的烟草相关失调指数是探索性的，需在更大独立队列中验证后才能广泛应用。此外，预测的功能映射表明，微生物组通过从正常营养处理转向毒素降解和硝酸盐/亚硝酸盐还原来适应这种化学应激。本研究虽样本量小，但提供了强有力的假设生成基线，强调慢性化学应激如何驱动平衡的口腔生态系统沿连续体向促炎、高风险生态位转变。最终，这项探索性研究提供了初步见解，并强调需要更大规模、生物学重复的多组学研究来验证这些微生物标志物，并更好地理解无烟烟草暴露与口腔疾病进展之间的联系。
