综述：先进测序方法用于龈下微生物组：技术选择、质量控制与牙周研究最佳实践

《Bacteria》：Advanced Sequencing Approaches for the Subgingival Microbiome: Technology Selection, Quality Control, and Best Practices in Periodontal Research

　　

测序技术已经重塑了龈下微生物组的研究，但由于分辨率、成本、宿主DNA污染和计算复杂性的差异，选择适当的方法仍然具有挑战性。本综述比较了16^S rRNA测序（16^S rRNA sequencing）、全长16^S（full-length 16^S）、鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）和宏转录组学（metatranscriptomics）在分类学分辨率（taxonomic resolution）、功能输出（functional output）、样品要求（sample requirements）和分析局限性（analytical limitations）方面的差异。强调了关键的实际问题，包括低微生物生物量（low microbial biomass）、污染控制（contamination control）和适当生物信息学工具（bioinformatic tools）的选择，以帮助研究人员避免常见陷阱。提供了一个决策框架（decision-making framework），将研究目标与合适的测序方法联系起来，同时概述了现实的预算和样品处理限制。综述最后提出了将测序与互补技术相结合的建议，以提高牙周微生物组研究（periodontal microbiome studies）的准确性、可重复性和临床相关性。

论文主体部分内容总结如下：

**1. Introduction**

龈下牙菌斑生物量低、宿主DNA丰富且结构高度组织化，因此方法选择并非中立，它会显著影响哪些微生物被检出以及哪些结论可被支持。本综述综合了当前关于龈下微生物组分析的测序技术证据，并基于研究目标、样本特征和可用资源，为方法选择提供实用指导。标记基因（16^S rRNA）调查适用于大规模队列和多样性模式分析，但分类分辨率有限且功能推断为间接方式。鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）可解析物种/菌株和基因，但人类DNA常主导文库并改变成本效益。全长16^S（PacBio HiFi）能以低于鸟枪法测序的成本填补部分分类空白，但缺乏直接功能读数。建议采用问题优先设计，选择能回答临床或机制问题的最简单检测方法，并配合严格的污染控制和成分统计。龈下微生物组是一个高度复杂的动态生态系统，包括细菌、古菌、真菌和病毒，其失调与牙周病进展相关，并与多种全身性疾病有关。近期测序技术发展革新了对牙周发病机制的认识，16^S rRNA测序揭示了核心微生物组和疾病相关分类群，鸟枪法宏基因组学阐明了功能潜能和菌株水平多样性，宏转录组学则为疾病和治疗中的活跃微生物过程提供了新视角。不同平台检测的生物域不同，16^S仅针对细菌和古菌，研究真菌和病毒需用鸟枪法宏基因组学和宏转录组学。本综述旨在将常见牙周研究目标与最合适的测序策略联系起来，并基于研究目标、生物约束和可用资源提供实用决策指导。

**2. Materials and Methods**

**2.1. Review Design and Scope**：本综述采用叙事性综述方法，综合当前关于龈下微生物组分析的先进测序技术证据，适用于快速发展的技术领域。

**2.1.1. Literature Search Strategy**：在PubMed/MEDLINE、Web of Science和Google Scholar等数据库中进行全面检索，使用MeSH/THES和自由文本术语，涵盖口腔和牙周微生物组、测序技术及主要方法学步骤。包括“subgingival microbiome”、“16S rRNA sequencing”、“shotgun metagenomics”、“metatranscriptomics”等关键词，以及“sample collection”、“contamination control”、“host DNA depletion”、“compositional analysis”和“STORMS guidelines”等。

**2.1.2. Study Selection and Data Synthesis**：初始检索获得642条记录，经标题/摘要筛选后保留211篇，全文评估后最终纳入120项研究。纳入标准包括人类受试者（牙周健康或疾病）、样本来自龈下菌斑、龈上菌斑或唾液，使用高通量测序方法（16^S rRNA、鸟枪法宏基因组学、宏转录组学或长读长测序），排除非人类研究、仅依赖培养技术或qPCR的研究等。总结了每项合格研究的设计、人群特征、样本收集与储存、测序技术和生物信息学流程、质量控制措施、统计考量及技术性能的主要发现，并进行了主题分析，而非荟萃分析。质量评估包括样本量、阴性对照、生物信息学透明度及对STORMS和MIMARKS报告指南的遵循。

**3. Overview of Sequencing Technologies for Subgingival Microbiome Research**

每种测序方法在检测龈下菌斑中生物类型方面存在差异。标准16^S rRNA测序仅捕获细菌和古菌，不提供真菌或病毒信息。鸟枪法宏基因组学覆盖所有主要微生物域，包括细菌、古菌、真菌和病毒，并可同时解读宿主DNA。长读长平台如PacBio和Oxford Nanopore也能检测多个域并产生更完整的组装，但成本较高。宏转录组学通过测量活跃表达的微生物和宿主基因，延伸至生物鉴定之外，特别适用于研究微生物组与宿主之间的功能相互作用。

**3.1. 16S rRNA Gene Sequencing**：16^S rRNA基因测序是一种标记基因方法，成本相对较低，支持大规模流行病学研究，具有成熟的标准化流程（如QIIME 2和DADA2）。主要限制包括分类分辨率有限，通常只能达到属水平，种水平分类困难，菌株水平几乎不可能；功能预测（如PICRUSt2）基于参考基因组，需谨慎解释；引物选择和可变区特异性会影响微生物群落代表性，引入偏差。

**3.2. Shotgun Metagenomics**：全基因组鸟枪法（WGS）宏基因组学通过测序样本中所有基因组DNA，提供更高分辨率，实现准确的种和菌株水平分类，并直接提供功能潜能信息（代谢途径、毒力因子、抗生素耐药基因）。主要限制是宿主DNA污染严重（可占龈下样本总DNA的90%以上），导致测序成本大部分用于宿主基因组；样本成本显著高于16^S测序，阻碍大规模分析；数据分析计算强度大，需要专门工具和资源。

**3.3. Metatranscriptomics: Unveiling the Active Microbiome**：宏转录组学通过测序所有RNA转录本，测量微生物群落的功能表达，提供实时响应（如健康与疾病转变）的微生物功能信息。示例表明，在牙周炎中P. gingivalis和T. forsythia的特定毒力因子基因表达上调。主要限制包括RNA不稳定，需严格采样和保存（如液氮速冻）；细菌中rRNA占绝大多数，需有效去除rRNA以聚焦mRNA；成本显著高于16^S和WGS，数据分析更复杂。

**3.4. A Comparative Framework for Technology Selection**：选择技术需权衡分类分辨率、功能信息、成本和研究问题。大规模流行病学研究中16^S rRNA测序最实用，需要精确物种/菌株鉴定或功能潜能时需鸟枪法宏基因组学，宏转录组学应保留用于研究特定表型下的活跃功能过程。集成方法（先大规模16^S调查，再对有信息样本进行深度WGS或宏转录组学分析）可能提供最全面的见解。

**4. Methodological Considerations in Subgingival Microbiome Research**

研究质量和准确性高度依赖于从样本采集到最终数据分析的整个研究过程中的方法学决策，龈下沟的特殊环境（低微生物量、高宿主DNA、确定的生物膜结构）增加了这些决策的影响。

**4.1. Dental Plaque Collection Methods**

**4.1.1. Curette Sampling**：刮匙被认为是金标准方法，能采集整个牙周袋的生物膜，获得更高微生物生物量和物种丰富度，包括紧密附着的微生物。但该方法具侵入性，需要临床经验，可能引起患者不适，且样本质量易受隔离情况影响，有被龈上菌斑或唾液污染的风险。研究一致表明刮匙样本比纸尖样本具有更高的物种丰富度和Shannon多样性。

**4.1.2. Paper Point Sampling**：纸尖采样操作简单、学习曲线低、患者痛苦小，适合大规模研究和临床监测。但主要采样松散附着在生物膜表面的细菌，获得的生物量较低，导致细菌多样性低于刮匙采样。此外，无菌纸尖本身可能携带背景DNA污染（如Exiguobacterium、Enterococcus、Pseudomonas），因此需将未使用的纸尖作为阴性对照纳入质量控制。

**4.2. Sample Processing and Storage**：最佳做法是采集后立即处理样本，否则应置于冰上并在数小时内处理。DNA研究长期保存需-80°C，宏转录组学研究需立即液氮速冻后-80°C保存以防RNA降解。保存介质（如TE缓冲液、PBS）有助于维持样本质量，但最佳介质取决于下游分析。应限制冻融次数，并通过在采集时制备等分样本来减少冻融循环。

**4.3. Quality Control and Contamination Management**：龈下菌斑微生物生物量低，污染在采样、提取和测序的每一步都是关键问题。污染源可能来自采样器械、纸尖、临床环境、提取试剂盒或实验室试剂，其影响在PCR扩增中被放大。必须使用适当的阴性对照（未使用的无菌刮匙或纸尖、仅试剂提取空白），与临床样本平行处理，以识别并去除污染物。常规工作流程应包括物理分离前PCR和后PCR区域、洁净紫外线处理工作台、过滤枪头。测序定义的模拟群落可揭示提取或扩增偏差，宿主DNA去除策略需谨慎测试并记录微生物产量损失。计算工具（如Decontam）可区分真正低丰度生物与污染物。标准化操作程序（SOPs）和STORMS清单有助于提高数据完整性和可重复性。

**4.4. 16S rRNA Amplicon Sequencing in Periodontal Research**：16^S rRNA扩增子测序是牙周病学中最常用的方法，成本约每样本50美元，适用于大规模队列研究。引物靶向区域的选择显著影响分类分辨率，V1-V3区域对口腔分类群的分辨率优于V3-V4，V1-V2区域被认为是最佳选择，针对HOMD数据库的验证至关重要。现代分析已从OTU聚类转向ASV方法，推荐使用QIIME 2和DADA2，差异丰度检验应使用考虑成分约束的方法（如ANCOM-BC2）。基于HOMD训练的口腔特异性分类器可将物种水平分配提高15-20%，PICRUSt2可实现功能预测但需验证。大规模研究（如Arredondo等人）揭示了牙周炎的核心属和人群特异性模式。

**4.5. Full-Length 16S Sequencing with Long-Read Technologies**：使用PacBio HiFi或Oxford Nanopore的全长16^S测序是短读16^S与鸟枪法宏基因组学之间的折中方案，通过测序整个~1500 bp的16^S rRNA基因，显著提高分类分辨率，同时保持标记基因调查的简单性和较低成本。研究表明全长16^S可对口腔样本中约95%的物种进行准确物种分配，而V3-V4区域仅约65%。应用包括菌株水平流行病学追踪、种植体周围炎研究等。对于中等样本量（50-200样本）需要物种水平分辨率的研究，全长16^S比鸟枪法宏基因组学更具成本效益，但缺乏功能信息，成本高于短读16^S，不适用于大规模流行病学或需要功能信息的研究。

**4.6. Shotgun Metagenomics: Comprehensive Genomic Analysis**：鸟枪法宏基因组学可评估微生物种群中的所有遗传物质，实现物种/菌株水平的分类和功能解析。主要挑战是龈下样本中人类DNA占70-90%，需要高测序深度或宿主去除方案。浅层鸟枪法宏基因组学（1-5百万微生物读段）在检测毒力基因和抗生素耐药标记方面仍优于16^S，但可能不足以进行全面的功能谱分析。宿主去除策略（如皂苷法）需谨慎验证。研究（如Manzoor等人）在唾液样本中识别出早期牙周病的微生物和功能生物标志物，跨国研究揭示了地理差异。HUMAN3流程可量化代谢途径丰度，功能分析显示牙周炎患者龈下部位氨基酸降解途径增加。菌株水平分析（如P. gingivalis的fimA基因型）与严重牙周炎相关。成本为每样本200-500美元，计算复杂度高，应避免用于简单多样性调查或预算受限的情况。

**4.7. Long-Read and Hybrid Assembly Approaches**：长读长测序（PacBio HiFi和Oxford Nanopore）在组装口腔群落中大基因组区域和生成高质量宏基因组组装基因组（MAGs）方面具有优势，尤其在解析重复区域和移动遗传元件（MGEs）时。PacBio HiFi可为口腔样本中60-80%的丰富物种产生完整或近乎完整的基因组，而短读仅为20-30%。混合组装（长读长支架+短读抛光）可达到与纯长读长相当的质量，但成本降低至60-70%。应用包括分析P. gingivalis的泛基因组（约40%基因为附属基因），以及研究整合性接合元件（ICEs）在抗生素耐药和毒力因子传播中的作用。Oxford Nanopore的适应性采样技术对宿主去除的实际效果有限（富集因子<2倍），实时病原体检测可在4-6小时内完成，但成本效益不足。限制包括原始读长准确性（在均聚物区域错误率1-5%）、成本较高，不适用于仅需标准多样性指标或快速周转的研究。

**4.8. Metatranscriptomics: Capturing Active Microbial Processes**：宏转录组学直接测量微生物基因表达，识别疾病状态下实际活跃的途径。荟萃分析（Ovsepian等人）发现50个基因家族（涉及跨膜转运、分泌、氨基酸代谢等）在疾病中表达上调，四种关键毒力因子基因（如P. gingivalis的TonB依赖受体、T. forsythia的表面抗原BspA等）转录激活显著增加。纵向研究（Duran-Pinedo等人）识别出微生物活动的三个连续阶段：第一阶段粘附和生物膜形成基因表达增加，第二阶段毒力因子和宿主组织降解酶基因表达增加。治疗反应研究显示，刮治和根面平整后1周内功能基因表达迅速变化。早期工作建立了宏转录组学在理解口腔菌群失调中的强大作用。应用已扩展到种植体周围炎等。技术挑战包括RNA降解、rRNA去除（需针对细菌的特定试剂盒）、成本较高和数据分析复杂，但提供了DNA测序无法获得的独特信息。

**4.9. Complementary Spatial Techniques**：高通量测序均质化了空间组织的生物膜群落，忽略了空间分布对功能的影响。组合标记和光谱成像荧光原位杂交（CLASI-FISH）可在微米水平研究龈下生物膜的结构，同时标记和成像不同细菌的空间位置。虽然CLASI-FISH不是测序方法，但提供了互补的空间信息，与qPCR、培养法或功能成像结合使用，有助于确认分类群是否占据特定生态位或存在有意义相互作用，从而产生更完整的生物学解释。空间组织对治疗有重要影响，生物膜亚群对抗菌剂的反应不同，空间异质性可能导致耐药区域。

**4.10. Bioinformatics and Statistical Considerations**：人类微生物组数据具有成分性，传统统计方法（t检验、ANOVA、回归）易产生虚假结果。需使用专门工具，如log-比率变换和ANCOM-BC2进行差异丰度检验，同时处理多重比较和成分效应。数据中零值常见，中心对数比率（CLR）变换处理零值的方法包括乘性替换、贝叶斯方法等，不推荐使用伪计数。机器学习工具需注意批次效应和过拟合，可解释性机器学习（如SHAP）能识别驱动预测的特定分类群或功能类别。共现网络分析需谨慎，相关性不代表因果关系，新方法可区分直接和间接相互作用。

**4.11. Data Management, Reproducibility, and Reporting Standards**：为确保可重复性，原始测序数据需存入公共数据库（如SRA或ENA），并附有充分元数据（遵循MIMARKS标准）。处理后的数据应提供各步骤输出文件，生物信息学流程需详细记录软件版本和参数，使用版本控制（如GitHub）和容器化（如Docker/Singularity）确保可重复性。报告需包括测序质量指标、阴性对照检测到的污染水平、技术重复一致性等。使用模拟群落和添加内标可验证整个分析流程，结果验证可采用独立数据集或不同分析方法（如qPCR）。STORMS清单是撰写稿件的有用资源。

**4.12. Future Perspectives and Emerging Technologies**：单细胞测序可研究微生物群落中的亚群和稀有细胞，显示细胞间基因表达变异，表型异质性影响生物膜功能和抗生素耐药。空间转录组学方法可绘制完整生物膜结构中的基因表达图谱。机器学习（包括深度学习）越来越多地用于识别多组学数据中的复杂模式和预测治疗结果，多组学整合可能揭示宿主-微生物组之间未见的关系。靶向微生物组的治疗（益生菌、益生元、精准抗菌剂）正在开发，测序技术在开发和监测这些疗法中至关重要。

**4.13. Implications Summary**：测序平台的选择影响分类分辨率和可回答的生物问题。16^S rRNA数据适用于群落水平变化，鸟枪法和宏转录组学方法对于理解毒力、耐药和代谢途径是必要的，长读长测序进一步支持菌株水平流行病学。临床医生和研究人员需根据这些区别判断何时简单方法足够，何时需要深度测序。

**4.14. Limitation of the Review**：本综述为叙事性而非系统性，选择偏倚无法完全排除。成本估算为近似值，随平台和地区变化。快速发展的测序技术可能导致某些细节在短时间内过时。宏基因组学和宏转录组学研究的功能解读因流程而异，限制了直接可比性。

**5. Conclusions**

为龈下微生物组研究选择合适的测序方法取决于研究问题、所需分类分辨率、样本生物量和可用资源。16^S rRNA测序适用于多样性调查和大规模队列，鸟枪法宏基因组学适用于菌株水平分辨率和功能谱分析，全长16^S在需要种水平鉴定但预算有限时提供实用折中方案，宏转录组学最适合量化活跃微生物功能或宿主-微生物组反应，但需严格RNA处理。无论选择何种平台，研究人员必须纳入污染控制、记录所有分析步骤并使用成分统计以确保准确性和可重复性。随着牙周微生物组研究向临床转化和个性化治疗策略发展，将测序与互补分子方法整合将变得越来越重要。