优化转录与翻译过程以提高枯草芽孢杆菌中β-半乳糖苷酶的表达水平

《Food Bioscience》：Transcriptional and translational optimization for enhancing β-galactosidase expression in bacillus subtilis

　　

摘要

半乳寡糖是一类重要的功能性低聚糖，在食品、农业和制药领域有着广泛的应用。β-半乳糖苷酶是实现半乳寡糖可持续生物合成的关键生物催化剂。在本研究中，从肠杆菌属HK169菌株中分离出一种属于糖苷水解酶2家族的β-半乳糖苷酶（Ensp β-gal）。在最佳条件（55℃、pH 7.5以及1 mM Mg²⁺）下，纯化后的该酶具有高达527.30 U/mg的比活性。随后，通过系统的转录和翻译优化，将该酶在食品级枯草芽孢杆菌中异源表达。研究人员筛选了14种启动子用于调控转录，同时评估了12种5′-非翻译区以及17种N端编码序列对翻译过程的调控作用。最终选用表现最佳的phrE启动子，通过对5′-非翻译区和N端编码序列进行组合工程改造，得到了最优的重组菌株BS-β-galS17。在该菌株的摇瓶培养中，其发酵活性最高可达584.15 U/mL，是对照菌株的57.24倍，这一数值为目前在枯草芽孢杆菌中报道的最高β-半乳糖苷酶发酵活性。此外，该菌株的发酵液还能直接催化半乳寡糖的合成，半乳寡糖的产率可达44.04%。

引言

半乳寡糖是一类非常重要的功能性低聚糖，它由2到8个通过糖苷键连接起来的半乳糖残基构成，末端还有一个葡萄糖残基。半乳寡糖的糖链主要通过β-(1→3)、β-(1→4)或β-(1→6)糖苷键相连（K. Wang, Duan, Sun, Zhang, & Lu, 2024; Aburto, Guerrero, Vera, Wilson, & Illanes, 2016）。作为一种高效的食物级益生元，半乳寡糖能够选择性地促进包括双歧杆菌和乳酸菌在内的有益肠道细菌的生长和定植（Wu, et al., 2024）。它还可以增加短链脂肪酸的产生，降低结肠pH值，抑制肠道病原体的生长（Souza, Gabardo, & Coelho, 2022），同时还具有抗结直肠癌、促进钙吸收和降低胆固醇的生物活性（Costa, Schmitz, Camargo de Lima, Lehn, & Volken de Souza, 2025; Jin, et al., 2025）。半乳寡糖常与益生菌一起使用形成合生元，被广泛应用于婴儿食品中（Bonnet, et al., 2025）。此外，半乳寡糖还具有出色的物理化学性质，如低热量值（1.73 kcal/g）、适中的甜度（为蔗糖甜度的30%–60%）、优异的水溶性和较高的热稳定性，这些特性使其在食品、畜牧业和水产养殖业中得到广泛应用（Cheng, et al., 2025）。在食品制造领域，半乳寡糖可以改善酸奶（Prasad, Sherkat, & Shah, 2013; Li, et al., 2025）、巧克力（Homayouni Rad & Rasouli Pirouzian, 2021）以及糖果（Lans, Frelka, Paluri, & Vodovotz, 2018）的口感和风味，还可部分替代蔗糖。在婴儿配方奶粉中添加半乳寡糖，有助于促进肠道内双歧杆菌的生长（Ambrogi, et al., 2023）。

半乳寡糖的化学合成极为复杂，而工业上生产半乳寡糖主要依靠β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23，β-半乳糖苷酶）的催化作用来实现（K. Wang, et al., 2024）。β-半乳糖苷酶兼具水解和转半乳糖基化两种功能，是将其它糖类转化为半乳寡糖最常用的酶类。根据CAZy数据库的分类系统，β-半乳糖苷酶属于多种糖苷水解酶家族，包括GH1、GH2、GH35、GH42、GH59、GH147和GH154家族（Hameleers, Pijning, Gray, Fauré, & Jurak, 2024; Jin, et al., 2026）。尽管β-半乳糖苷酶在多种微生物中普遍存在，但高质量的同源酶资源十分稀缺，这严重限制了半乳寡糖的工业化发展。因此，获得具有高转半乳糖基化效率的β-半乳糖苷酶，并通过优化表达方式提高其产量，对于高效生产半乳寡糖具有重要意义。

高效的异源表达对于获得高产量的β-半乳糖苷酶至关重要。大肠杆菌因其遗传背景清晰、生长速度快且蛋白质表达效率高等优点，被广泛用作表达宿主，但其内毒素含量限制了其在食品和制药领域的应用。通常，酵母会被用作食品级的表达宿主。来自硫氧化叶菌的β-半乳糖苷酶突变体F441Y已在巴斯德毕赤酵母KM71中成功表达。经过80小时的甲醇诱导后，该重组酶的活性达到了204.9 U/mL（Sun, Duan, Wu, Chen, & Wu, 2014）。此外，来自地热硫杆菌的一种新型β-半乳糖苷酶也在以巴斯德毕赤酵母为异源表达宿主的条件下以分泌形式得到了高效表达。经过6天的甲醇诱导后，该酶的活性达到了68 U/mL（Zerva, et al., 2021）。虽然巴斯德毕赤酵母具有出色的发酵酶活性，但其表达通常需要甲醇诱导，且发酵周期一般比枯草芽孢杆菌更长。

枯草芽孢杆菌是一种符合GRAS标准的工业用宿主，它不含内毒素，具备出色的蛋白质分泌能力且生物安全性高，因此是实现半乳寡糖绿色工业化生产的理想载体。然而，目前在中枯草芽孢杆菌中异源表达β-半乳糖苷酶的效率较低，酶活性和产量都不高，无法满足大规模工业生产的需求（见表1）。例如，将来自嗜热脂肪地芽孢杆菌IAM11001的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌168中异源表达后，其在发酵上清液中的胞外活性仅为1.10 U/mL（Xia, et al., 2010）。来自巨芽孢杆菌YZ08的β-半乳糖苷酶（Zhao, et al., 2018）以及来自阿里亚巴塔芽孢杆菌GEL-09的β-半乳糖苷酶（Duan & Luan, 2023）分别在枯草芽孢杆菌WB800和WB600中得到异源表达，其胞外酶活性仅为17.55 U/mL和17.41 U/mL。不过，这样的低活性水平显然无法满足工业应用的需求。后来，程等人将来自稻曲菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌WG600中异源表达，使得上清液中的酶活性达到了106.2 U/mL（Cheng, et al., 2025）。Senger等人进一步在枯草芽孢杆菌SCK6中表达了来自温氏多粘芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶，使该酶的活性提升到了165.36 U/mL（Jana Senger, Schulz, Seitl, Heider, & Fischer, 2025），这一数值是本研究之前报道的最高值。

在本研究中，研究人员从肠杆菌属HK169菌株中分离出一种新型的GH2家族β-半乳糖苷酶（Ensp β-gal），该酶不仅具有较高的酶活性，还具备出色的半乳寡糖合成能力。随后，通过pP43NMK载体将该酶的编码基因在食品级宿主枯草芽孢杆菌WG600中进行了异源表达。通过启动子、5′-非翻译区和N端编码序列这三个关键遗传要素的协同调控，有效提高了Ensp β-gal的表达水平。这种构建的食品级高效表达系统为半乳寡糖的绿色大规模工业化生产提供了一种新的技术途径，具有很大的商业应用前景。

章节节选

质粒、菌株和试剂

本研究所使用的宿主菌株包括大肠杆菌BL21（DE3）、大肠杆菌DH5α以及枯草芽孢杆菌WG600，这些菌株均保存在我们的实验室中（本研究所使用的所有菌株的详细信息均列于表S1中）。基因合成工作是由北京青科生物技术有限公司完成的（中国北京）。用于鉴定重组质粒的测序工作则由Genewiz公司承担（中国苏州）。实验中使用的所有化学试剂均为分析级纯度产品。

Ensp β-gal的挖掘与氨基酸序列分析

由于相比其他GH2家族的酶类，来自阴沟肠杆菌的β-半乳糖苷酶具有更高的半乳寡糖合成能力（51.73%），并且在突变工程方面具有更大的潜力，因此被选为参考酶。而像环状芽孢杆菌产生的β-半乳糖苷酶虽然也能产生较高的半乳寡糖产量，但这类酶已经实现了高度商业化，因此在探索新的结构特征或开发新的工程应用潜力方面的空间相对有限。在该酶的三个关键氨基酸残基上

结论

在本研究中，研究人员从肠杆菌属HK169菌株中分离出一种GH2家族的β-半乳糖苷酶。该酶的比活性高达527.30 U/mg，半乳寡糖的产率为46.03%。随后，将该酶在食品级枯草芽孢杆菌中进行了异源表达，其发酵活性达到了10.03 U/mL。通过对启动子、5′-非翻译区和N端编码序列进行系统的组合工程改造，最终将β-半乳糖苷酶的发酵活性提升到了584.15 U/mL，这一数值是初始水平的57.24倍

CRediT作者贡献说明

程卓：撰写——初稿、可视化分析、实验研究、正式分析。 彭秋子：撰写——审阅与编辑、正式分析。 陈佳军：撰写——审阅与编辑、验证工作。 徐伟：撰写——审阅与编辑。 佩恩卡·佩特罗娃：撰写——审阅与编辑。 万丽：撰写——审阅与编辑。 倪大伟：撰写——审阅与编辑、实验研究。 穆万蒙：撰写——审阅与编辑、实验研究。 卡洛扬·佩特罗夫：撰写——审阅与编辑。 张文利：撰写——审阅与

未引用参考文献

Gao et al., 2019; Senger et al., 2025; Wang et al., 2024.

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性

本研究中使用的数据属于保密信息。

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2025YFE0100800）以及江南大学食品科学与资源国家重点实验室的研究项目（SKLF-ZZA-202611和SKLF-ZZB-202603）的支持。

Zhuo Cheng|Qiuzi Peng|Jiajun Chen|Li Wan|Dawei Ni|Wei Xu|Penka Petrova|Kaloyan Petrov|Wenli Zhang|Wanmeng Mu

中国江苏省无锡市江南大学食品科学与技术学院食品科学与资源国家重点实验室，邮编214122