一种利用稳定同位素稀释法与HS-SPME-GC-MS技术对草莓（Fragaria × ananassa）中关键挥发性香气成分进行定量分析的新方法，用于基于风味的育种工作

《Food Chemistry》：A novel approach to quantitative characterisation of key volatile aroma compounds in strawberry ( Fragaria × ananassa) using stable isotope dilution assay and HS-SPME-GC-MS for flavour-driven breeding

　　

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  针对澳大利亚草莓中挥发性风味化合物的基质匹配型SIDA-GC–MS-HS-SPME分析。
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  方法验证。
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  对澳大利亚种植的草莓品种及育种材料中的关键香气化合物进行定量分析。

引言

草莓（Fragaria × ananassa）是全球栽培最广泛的果树之一，因其甜美的芳香风味、健康益处，以及在鲜食、果酱、各类食品和调味品中的多种应用而备受重视（Amoriello等，2022；Fan等，2021；Gaston等，2020；Kuchi & Sharavani，2019；Li等，2009）。近年来全球草莓产量持续增长，中国和美国等主要生产国为产量提升做出了重要贡献（World Population Review，2025）。草莓的果实品质提升了其在行业中的认可度，而提升草莓风味、培育具有独特风味特征的品种仍是草莓育种计划的核心目标（De Silva，2019）。

草莓的果实风味被描述为甜味、果香、花香、青草味、黄油味和酸味的混合体（Samykanno等，2013b）。这种风味是由糖类（主要是葡萄糖、果糖和蔗糖）、有机酸（主要是柠檬酸、苹果酸和谷氨酸）等非挥发性化合物，以及大量挥发性香气化合物之间的复杂相互作用决定的（Gaston等，2020）。尽管香气挥发物仅占新鲜草莓重量的0.001%到0.01%，但它们对草莓的食用品质有着重要影响（Cannon等，2015；Forney等，2000；Jouquand等，2008；Samykanno等，2013b；Ulrich等，1997）。截至目前，已发现草莓中含有360多种挥发性化合物（Li等，2009），包括酯类、醛类、有机酸、酮类、醇类、萜烯类、呋喃酮类、内酯类和硫化合物（Du, Plotto等，2011；Forney等，2000；Oz等，2016；Ulrich等，2018；Vandendriessche等，2013；Zabetakis & Holden，1997）。然而，尽管存在大量挥发性物质，只有少数几种对草莓风味有显著影响。了解这些关键化合物及其在草莓香气和风味中的作用，有助于优化育种计划，从而提升果实品质（Porter等，2023）。

液液萃取法（LLE）被认为是一种能够准确提取挥发性化合物的方法，因为它可以直接从样品中分离出挥发性物质。不过这种方法往往耗时较长（Temerdashev等，2021）。为克服这一缺陷，顶空固相微萃取法（HS-SPME）被广泛采用，它是一种相对简单、快速、成本低且无需溶剂的提取技术，可用于挥发性物质的提取与定量分析（Sánchez-Palomo等，2005）。HS-SPME与气相色谱-质谱法（GC–MS）结合，已被用于多种研究，旨在检测草莓中的香气挥发物并实现不同目的（Jo等，2024；Kim等，2022；?z等，2024；Padilla-Jiménez等，2021；Zhang等，2025；Zheng等，2023）。尽管具有诸多优势，HS-SPME仍可能受到基质效应及其他变量因素的影响，比如质谱检测器的响应情况以及离子强度，这些因素都可能影响定量结果的准确性和精确度（Li等，2009；San等，2017）。在传统的HS-SPME-GC-MS分析流程中，这些因素常常会导致不同化合物的萃取效率存在差异，检测器响应也不稳定，因此该方法主要适用于样本间的相对或半定量比较（George等，2024；Li等，2009；San等，2017）。评估基质效应十分重要，因为SPME分析结果会受到挥发性化合物与样品基质之间复杂相互作用的强烈影响（Ibanez等，1998；Raffo等，2015）。为减轻这些影响，人们会使用与样品基质匹配的校准曲线来对目标草莓挥发物进行定量分析，从而确保结果的准确性和精确度。以脱臭草莓为基底制成的标准样品可作为“匹配基质”，用于制备标准加标样，进而实现对方法的最佳校准（George等，2024；Raffo等，2015）。然而，由于草莓基质的复杂性——其中含有多种化学成分，它们在非均一的结构中相互作用，影响着挥发性和香气释放——要创建一个能够完全模拟顶空中挥发性成分相互作用的外部标准极为困难（Samykanno等，2013a）。因此，使用模拟草莓基质可作为实用的替代方案。此外，HS-SPME属于半定量技术，因为它在实现挥发性化合物的绝对定量分析方面存在局限性（Fischer等，2021）。分析物被纤维吸附的程度取决于分析物在样品基质、顶空和纤维涂层之间的特异性分配情况，同时还与涂层类型及其对不同挥发性物质的亲和力有关（Diaz-Maroto等，2002）。因此，信号强度并不能直接反映分析物的绝对浓度，尤其是在复杂的食品基质中。为解决这一问题，挥发性分析领域采用了稳定同位素稀释分析法（SIDA），该方法具有较高的精确度和准确性（Li等，2009）。在风味化学研究中，这种绝对定量分析对于保证数据可比性至关重要。在该方法中，会将目标挥发物的标记同位素衍生物作为内标加入样品中，以此抵消基质效应、萃取过程中的变异以及仪器波动，从而提高定量分析的可靠性。虽然SIDA与液液萃取法结合使用（SIDA-LLE）能够为草莓香气化合物提供高精度的定量分析结果，但这种方法耗时较长、工作量较大，不太适合育种计划中所需的高通量分析（Temerdashev等，2021）。相比液液萃取法，SIDA与HS-SPME-GC-MS相结合的分析方法被认为具有更高的准确性、精确度、速度和灵敏度，尤其适用于分析低挥发性和极性较强的气味物质（San等，2017）。不过，由于本研究的目标是方法开发与应用，而非分析方法的对比评估，因此并未进行不同方法之间的直接对比。相关优势是基于已有原理和已发表的文献进行论述的。研究人员已经成功将SIDA和HS-SPME-GC-MS技术应用于多种水果的关键香气挥发物定量分析，比如芒果（San等，2017）和菠萝（George等，2024）。虽然此前已有研究将SIDA与液液萃取法结合用于草莓香气挥发物的分析（Schieberle & Hofmann，1997；Song等，2023），但尚未有研究报道将该方法与HS-SPME-GCMS结合用于此类分析。

为了准确量化草莓中的挥发性物质，同时克服传统液液萃取法和半定量HS-SPME技术的局限性，尤其是基质效应、萃取效率问题以及缺乏绝对定量能力的问题，有必要采用新的分析方法。因此，本研究的目的是开发一种快速、准确且精确的分析方法，将该方法与SIDA、HS-SPME和GC–MS相结合，用于分析澳大利亚草莓品种及育种材料中的特色香气。该方法的创新之处在于采用了与样品基质匹配的标准加标校准方式，从而进一步提升分析精度。预计这种分析方法能够准确量化草莓的挥发性成分特征，有效区分10个不同品种和育种材料之间的差异。从育种角度来看，对挥发性化合物进行定量分析有助于识别与相应风味活性化合物相关的遗传标记，进而推动将香气性状纳入标记辅助育种计划中。这一方法代表了草莓香气分析领域的重大进步，为快速、准确、精确地分析关键挥发性化合物提供了有效手段。将其应用于澳大利亚草莓育种计划中，有助于深入了解风味的遗传决定因素，进而培育出既符合行业标准又能满足消费者需求的优质草莓品种。

章节要点

材料与方法

在方法开发过程中，选择了13种关键的香气挥发物（见表1），选择依据是它们具有多样的风味特征，以及较低的嗅觉阈值——即人类嗅觉能够感知该化合物的最小浓度（Van Gemert，2011）。在选择时还考虑了这些化合物所代表的不同化学类别、在草莓中的天然含量较高，以及以往研究中有较多相关报道等因素（Du, Plotto等，2011；

校准曲线的线性关系

在与草莓基质匹配的条件下制备的校准曲线，在所有分析化合物的浓度范围内，通过视觉观察均显示出良好的拟合度（见表2）。大多数化合物都得到了线性模型，这些化合物包括1-戊烯-3-酮、乙基异戊酸酯、己醛、异戊酸异丁酯、(E)-2-己烯醛、1-辛烯-3-酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和γ-十二内酯。不过，对于乙酸乙酯、乙基异丁酸酯、芳樟醇、mesifurane和γ-癸内酯这几种化合物，则需要通过二次回归模型来构建校准曲线

结论

本研究针对澳大利亚草莓育种计划，选用代表性品种和育种材料，成功开发并验证了一种用于分析草莓中关键挥发性化合物的准确且精确的分析方法。SIDA与HS-SPME-GC–MS相结合的使用方式显示出极高的灵敏度，在与草莓风味相关的挥发性化合物的整个浓度范围内，都能得到决定系数较高的校准曲线。这一方法相较于传统分析技术有了显著改进

CRediT作者贡献说明

Dilmini Hettiarachchi：撰写——初稿撰写、可视化处理、方法验证、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念构建。Heather Smyth：撰写——审阅与编辑、研究指导、方法设计、实验研究、概念构建。Craig Hardner：撰写——审阅与编辑、研究指导、实验研究、概念构建。Daniel Cozzolino：撰写——审阅与编辑、研究指导、概念构建。Jodi Neal：撰写——审阅与编辑、研究指导、资源协调，

资金支持

该研究由Hort Frontiers先进生产系统基金资助，该基金是Hort Innovation推出的Hort Frontiers战略合作伙伴计划的一部分，格里菲斯大学、初级产业部、昆士兰大学也参与了投资，同时澳大利亚政府也提供了部分资金支持。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

Dilmini Hettiarachchi|Heather Smyth|Craig Hardner|Daniel Cozzolino|Jodi Neal|Katie O'Connor|Thoa T.L. Nguyen