裂褶菌菌丝体绿色提取及水解物制备的增值利用：基于蛋白质组学的抗氧化潜力与Caco-2细胞评估

《Food Chemistry: X》：Valorization of Schizophyllum commune mycelia through green extraction and hydrolysate preparation: Proteomics-informed antioxidant potential and Caco-2 cell-based assessment

　　

研究人员以深层发酵获得的裂褶菌（*Schizophyllum commune*）菌丝体为研究对象，探讨其作为生物活性成分可持续来源的潜力，采用涵盖绿色提取、蛋白质组学、计算机模拟（in silico）肽基序预测及Caco-2细胞实验的综合研究流程。在不同生物量负载和提取时间下，对热水提取（hot-water extraction, HWE）和超声辅助提取（ultrasound-assisted extraction, UAE）进行了比较。蛋白质的增溶量随生物量负载增加而显著上升，且不受提取方法影响；而多糖回收率主要取决于提取时间。在粗提物中，UAE所得酚类含量高于HWE。乌枪法蛋白质组学（shotgun proteomics）鉴定出312个高可信度蛋白质，从中选取部分蛋白作为抗氧化肽基序预测的候选前体序列。该水解物含有肽、多糖及酚类化合物，可使Caco-2细胞活力维持在90%以上，并以剂量依赖方式显著降低过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。上述发现为将该水解物进一步开发为功能性食品应用的多组分抗氧化配料提供了初步支持。

**论文解读：裂褶菌菌丝体的绿色提取增值与多组分抗氧化活性研究**

**研究背景与意义**

在生物精炼研究领域，真菌生物质的增值利用已成为满足可持续和多功能生物活性化合物需求的重要策略。食用和药用真菌，如双孢蘑菇（*Agaricus bisporus*）、毛木耳（*Auricularia polytricha*）、草菇（*Volvariella volvacea*）、裂褶菌（*Schizophyllum commune*）、灵芝（*Ganoderma lucidum*）、平菇（*Pleurotus ostreatus*）和灰树花（*Grifola frondosa*）等，是蛋白质、多糖、微量营养素和次级代谢产物的重要来源。这些化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物活性，使真菌代谢产物日益被视为功能性食品、营养保健品和治疗产品的宝贵资源。

裂褶菌是一种全球分布的真菌，其最著名的功能成分是β-葡聚糖裂褶菌素（schizophyllan），具有明确的免疫刺激、抗癌和抗氧化特性。其蛋白质含量约为干重的15%，必需氨基酸约占总氨基酸的34%，适合营养应用。然而，以往对裂褶菌的研究主要集中于裂褶菌素，其蛋白质部分受到的关注相对较少。该组分是一个尚未充分开发的资源，因为酶解可释放出具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性的短链生物活性肽，从而拓宽其增值潜力。此前唯一报道裂褶菌生物活性肽的研究（Wongaem等，2021）仅利用了子实体生物质，而子实体培养周期通常超过三周（约22天），在工业应用的可扩展性和一致性方面受限。相比之下，通过深层发酵（submerged fermentation, SmF）获得的菌丝体生物质具有生长快、培养可控、重现性高等优势，是更可持续的肽生产平台。在提取方法方面，热水提取（hot-water extraction, HWE）虽广泛用于真菌多糖提取，但高热输入可能引起多糖结构改变并降低抗氧化性能；超声辅助提取（ultrasound-assisted extraction, UAE）作为更绿色、非热、节能的替代技术，在裂褶菌菌丝体中的应用缺乏系统比较。因此，建立一种集成策略，对SmF来源的裂褶菌菌丝体进行绿色提取和生物活性评价，具有重要的研究价值和应用前景。

**研究内容概述**

本研究旨在建立可持续增值利用SmF来源裂褶菌菌丝体的集成策略。具体包括：（i）比较HWE和UAE对蛋白质、多糖和酚类化合物回收的影响；（ii）通过蛋白质组学分析鉴定可溶性蛋白；（iii）利用计算机模拟预测胰蛋白酶水解物中潜在抗氧化肽基序；（iv）在人类结直肠腺癌细胞（Caco-2）中评估水解物的细胞相容性和细胞内抗氧化活性。菌株TC001由泰国国立法政大学生物技术系提供，经ITS序列鉴定为裂褶菌。研究人员确定最佳收获时间后，通过HWE和UAE对不同生物量负载（0.1–0.5 g）和提取时间（UAE 0–80 min，HWE 0–120 min）下的提取效果进行了系统比较。基于比较结果，选择简单水提法（25°C磁力搅拌20 min）制备可溶性蛋白提取物，用于SDS-PAGE分析、LC-MS/MS乌枪法蛋白质组学鉴定和后续水解物制备。采用BIOPEP-UWM数据库对抗氧化肽基序进行计算机模拟筛选。最后，通过CellTiter-Blue?（CTB）法检测水解物的细胞毒性，利用DCF-DA荧光探针评估过氧化氢（H₂O₂）诱导的细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。

**主要技术方法**

本研究使用的主要技术方法包括：基于ITS区域测序的分子鉴定；深层发酵培养（30°C，200 rpm，13天）；热水提取（HWE，100°C）和超声辅助提取（UAE，25°C，80%功率）比较；福林酚法（Lowry法）测定蛋白质、苯酚-硫酸法测定多糖、Folin-Ciocalteu法测定总酚含量；傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征多糖结构；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白谱带；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）乌枪法蛋白质组学鉴定（数据库：UniProtKB Agaricomycetidae，检索软件：Proteome Discoverer? 2.5）；BIOPEP-UWM数据库进行计算机模拟肽基序预测；DPPH自由基清除实验评估粗提物抗氧化活性；Caco-2细胞（克隆C2BBe1，ATCC-CRL-2102）用于细胞活力（CTB法）和细胞内ROS（DCF-DA法）检测。

**研究结果**

**3.1 菌株TC001的分子鉴定及深层发酵生长特性**
通过ITS区域测序，获得566 bp片段，与裂褶菌（GenBank登录号MN490059.1）的序列同一性为99.65%（查询覆盖度99%），确认菌株TC001属于裂褶菌。在SmF条件下，生物量在前3天快速增加，同时葡萄糖浓度急剧下降，表明处于活跃的指数生长期。第5天葡萄糖完全耗尽，生物量达到稳定期。最大比生长速率（μ_max）为0.16 ± 0.04 day^-1，第13天的最终生物量浓度为10.73 ± 0.42 g/L。培养液pH从约5升至6.5（第5天），最终达到约7.3，可能与氮代谢和有机酸利用有关。菌丝体球直径在第1至第3天增大，第5天后趋于稳定。因此，选择第5天作为菌丝体收获时间点，以确保生理状态一致。

**3.2 HWE与UAE提取蛋白质、多糖和酚类化合物的比较**
蛋白质回收方面，两种方法提取的蛋白浓度均随生物量负载增加而升高（r = 0.990 UAE，r = 0.959 HWE），但几乎不受提取时间影响（r = 0.080 UAE，r = 0.005 HWE）。这表明回收的蛋白质主要是初始水化混合步骤中释放的易溶水溶性蛋白，而非通过超声或热处理破坏细胞壁释放的蛋白。蛋白提取率（mg/g）随生物量负载增加而下降，可能归因于高固含量下的传质限制。SDS-PAGE显示，0 min时蛋白条带比60 min时更强烈，提示长时间处理可能导致蛋白变性、聚集或降解。多糖回收方面，多糖浓度随提取时间和生物量负载增加而持续上升，与提取时间呈强正相关（r = 0.852 UAE，r = 0.846 HWE），与生物量负载仅中等相关（r = 0.393 UAE，r = 0.306 HWE），表明多糖回收主要依赖于时间，反映细胞壁结合多糖的逐步释放。两种方法在60 min时获得的多糖浓度相当。酚类回收方面，总酚含量（total phenolic content, TPC）随生物量负载增加而显著升高（r = 0.977 UAE，r = 0.874 HWE），但与提取时间几乎无关。按生物量归一化后酚类含量基本恒定。UAE产生的TPC始终高于HWE，可能因为超声处理减少了热敏性酚类化合物的热降解。DPPH自由基清除实验显示，UAE提取物的活性随提取时间增加而增强，而HWE提取物活性变化不明显。FTIR分析表明，HWE和UAE提取的多糖均保留了β-糖苷键（约928 cm^-1和883 cm^-1）和吡喃糖环结构，说明两种方法均未显著改变多糖的基本结构。综合比较，UAE有利于获得富含酚类和更高自由基清除活性的提取物，而简单水提即可有效回收蛋白质。

**3.3 SDS-PAGE分析和LC-MS/MS乌枪法蛋白质组学鉴定**
简单水提蛋白提取物的SDS-PAGE显示出11条主要条带。经LC-MS/MS分析，共鉴定出312个高可信度蛋白质。功能富集分析显示，这些蛋白质显著富集于翻译相关通路，包括核糖体结构、翻译起始和延伸、GTP依赖过程及胞质蛋白生物合成，反映菌丝体处于翻译活跃状态。全部鉴定蛋白的分子量主要分布在20–80 kDa，等电点（pI）主要在5–8之间。主要蛋白质条带被初步归属为核糖体蛋白（40S和60S亚基）、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、磷酸葡糖变位酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶等。

**3.4 抗氧化肽基序的计算机模拟分析**
选取25个对应SDS-PAGE主条带的蛋白作为前体序列进行BIOPEP-UWM分析。在蛋白水平上，超氧化物歧化酶（D8PT51）、核糖体蛋白L15（D8PPU3）和60S核糖体蛋白L20（D8QER8）含有最多预测抗氧化片段；小核糖体亚基蛋白uS7（D8QBZ9）的预测抗氧化活性指数（B）最高。重要代谢酶如葡萄糖-6-磷酸异构酶、磷酸葡糖变位酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶也含有预测的抗氧化肽基序。对LC-MS/MS实际检测到的胰蛋白酶肽进行进一步分析，肽段平均分子量约1.3 kDa，水解度为85.26 ± 0.93%。超过68%的独特肽序列含有预测抗氧化基序，其中最常出现的五个基序为LK、EL、FD、LT和VE。这些肽段富含色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸和酪氨酸等具有电子供体侧链的氨基酸残基，支持其潜在的抗氧化能力。

**3.5 水解物在Caco-2细胞中的细胞相容性和细胞内ROS衰减**
水解物在0.093–300 μg/mL浓度范围内均保持Caco-2细胞活力大于90%，表明其具有良好的细胞相容性。在1 mM H₂O₂诱导氧化应激后，单独H₂O₂处理组细胞内ROS在15–30 min急剧升高后逐渐下降，可能与Caco-2细胞内源性抗氧化系统有关。与H₂O₂对照组相比，水解物处理组表现出更强的ROS衰减效果，且随着水解物浓度增加，ROS降低作用增强，呈现剂量依赖性。由于水解物同时含有肽、多糖和酚类化合物，该抗氧化效应应视为整个多组分水解物的整体作用，而非仅由抗氧化肽单独贡献。

**总结与讨论**

本研究通过绿色提取和水解物制备实现了对SmF来源裂褶菌菌丝体的增值利用。蛋白质回收通过简单水提即可高效完成，超声辅助提取则更有利于酚类化合物的回收和自由基清除活性的提升。LC-MS/MS蛋白质组学鉴定出可溶性菌丝体蛋白，可作为预测抗氧化肽基序的前体来源。胰蛋白酶消化产生了含有低分子量肽、多糖和酚类化合物的多组分水解物，该水解物在Caco-2细胞中表现出良好的细胞相容性并有效减轻H₂O₂诱导的细胞内ROS。由于未进行组分分离，观察到的细胞抗氧化效应应解释为整个多组分水解物的活性，而非多肽的独立效应。讨论部分指出，未来的研究应开展直接化学抗氧化实验（如ABTS、ORAC等）、氧化应激生物标志物分析、分子量分级以及各组分贡献的验证，以阐明水解物抗氧化能力的具体机制。此外，还应对提取多糖进行分子量分布、单糖组成和β-葡聚糖定量等进一步表征，并评估感官特性、胃肠消化稳定性和在食品模型体系中的表现，以支持其实际应用。总体而言，这些发现为将裂褶菌菌丝体开发为功能性食品的多组分抗氧化配料提供了初步的科学依据，展示了深层发酵菌丝体作为可持续生物活性成分来源的潜力。