《Food Control》：NKL-24 exerts potent antimicrobial and antibiofilm effects against
Clostridium perfringens and reduces required level of sodium nitrite in pork sausage
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摘要产气荚膜梭菌因其快速生长和毒素产生而成为食源性疾病的重要致病菌。与传统抗菌剂相比，抗菌肽由于具有多种杀灭机制，不太可能引发细菌耐药性。因此，本研究旨在评估AMP NKL-24对产气荚膜梭菌营养细胞及生物膜的抗菌特性与作用机制。研究结果表明，随着浓度从0升高到40 μg/mL，
摘要
产气荚膜梭菌因其快速生长和毒素产生而成为食源性疾病的重要致病菌。与传统抗菌剂相比，抗菌肽由于具有多种杀灭机制，不太可能引发细菌耐药性。因此，本研究旨在评估AMP NKL-24对产气荚膜梭菌营养细胞及生物膜的抗菌特性与作用机制。研究结果表明，随着浓度从0升高到40 μg/mL，NKL-24可导致线粒体膜去极化，使细胞内ATP浓度从1074.8 nM降至935.8 nM。通过SYTO 9/碘化丙啶染色检测膜通透性后发现，用40 μg/mL NKL-24处理后，92.7%的细胞呈现PI阳性反应。扫描电子显微镜图像显示，NKL-24可通过破坏膜完整性导致细胞破裂。此外，通过结晶紫染色和共聚焦激光扫描显微镜分析，还发现了NKL-24对产气荚膜梭菌生物膜具有显著的抑制和清除作用，其抗生物膜机制包括抑制细胞存活以及破坏生物膜中的蛋白-多糖基质结构。NKL-24对Caco-2细胞的细胞毒性可忽略，小鼠体内也未出现急性毒性迹象，血清和器官功能也保持正常。最后，以猪肉香肠为模型进行试验，结果表明NKL-24与亚硝酸钠联合使用可通过抑制微生物生长和脂质氧化，显著延长样品的保质期。这些结果表明，NKL-24有望成为一种安全且多功能的食物防腐剂，能够有效降低猪肉香肠中亚硝酸钠的使用量。
引言
产气荚膜梭菌是一种厌氧、能形成孢子的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中普遍存在（Li等人，2023）。它广泛分布于土壤、食物以及人类和动物的肠道中。该菌具有在多种环境条件下生存的能力，还能产生多种毒素，包括α、β、ε、ι型毒素以及肠毒素（Xiao等人，2025）。由于与坏死性小肠结肠炎、气性坏疽和食源性腹泻等疾病相关，产气荚膜梭菌已成为发达国家中第二常见的食源性细菌病原体（Noor Mohammadi等人，2022）。例如，英格兰的流行病学数据表明，这种细菌约导致了8%-13%的食源性肠道疾病病例（Camargo等人，2024）。值得注意的是，产气荚膜梭菌的倍增时间极快，在最佳条件下甚至仅需10分钟即可完成一代繁殖（Priya等人，2023）。这一特性在食品加工后的污染过程中会带来重大风险，还会促使细菌在食品中再次生长。不过，这种快速生长的生存策略也使得细菌的营养细胞对环境变化较为敏感。为了抵御环境压力，产气荚膜梭菌进化出了适应性机制，能够通过自我聚集形成难以清除的生物膜（Zhang等人，2025）。
生物膜是由细菌自身分泌的胞外多聚物质矩阵所构成的高度有序的细菌群落，因此它们能够增强细菌对抗生素、氧化作用以及热应力的抵抗力（Hu等人，2021）。生物膜的形成使产气荚膜梭菌能够附着在基质表面，进而实现组织定植，并在感染进一步发展中发挥关键作用。目前，食品工业中控制生物膜的方法主要依赖于机械刷洗和超声处理等物理方法，以及次氯酸钠和过氧化氢消毒等化学方法（Zhang等人，2025）。然而，研究人员发现这些方法可能会促使细菌产生生物膜耐药性，从而增加防控的难度（Jarman等人，2024）。为了克服传统方法的局限性，开发具有新作用机制、不易引发耐药性的替代性抗生物膜策略已变得十分紧迫。
抗菌肽是一类在自然界中广泛存在的小分子肽，通常带有正电荷且具有两亲性结构（Satchanska等人，2024）。它们是先天免疫系统中重要的免疫相关成分，可作为抵御病原体感染的第一道防线（Shahrour等人，2025）。世界卫生组织指出，抗菌药物耐药性对公共卫生和全球发展构成了严重威胁（Bucataru & Ciobanasu，2024）。抗菌肽的优势在于其多种作用机制，使得细菌难以对其产生耐药性，因此即便面对耐药菌株，它们仍能发挥强大的抗菌作用（Xuan等人，2023）。其作用机制包括直接破坏微生物细胞膜的完整性，以及通过靶向特定细胞成分发挥细胞内作用。此外，有研究表明抗菌肽还能有效抑制细菌生物膜的形成（Kumar等人，2025）。越来越多的研究显示，利用具有优异抗菌特性的天然抗菌肽进行食品保存具有显著优势。例如，美国食品药品监督管理局已将乳链球菌素列为公认安全物质，为其作为食品防腐剂的应用铺平了道路（Santos等人，2018）。Du等人（2024）将来自戊糖乳杆菌PCZ4的杀菌素用于黑鲤鱼的保鲜处理，结果发现该杀菌素可使产品保质期延长2天，同时有效抑制水生气单胞菌的生长。Federico等人（2015）发现，从牛乳铁蛋白中提取的纯化抗菌肽Lfcin B在4℃下冷藏6天内，可将即食蔬菜的腐败程度降低36%，显示出其在食品保存领域的巨大潜力。
NK-溶菌酶是一种阳离子型抗菌肽，最初是在猪的胃肠道中被发现的，此后在多种哺乳动物和鱼类中也得到了研究（Yacoub等人，2024）。值得注意的是，NK-溶菌酶对包括细菌和真菌在内的多种微生物都具有抑制作用（Chen等人，2022；Ortjohann & Leippe，2025）。我们实验室此前曾报道了一种源自青鳉鱼的NK-溶菌酶衍生的新型抗菌肽NKL-24，它含有24个氨基酸残基。研究表明，该肽可通过作用于细胞膜的方式，对食源性病原体副溶血性弧菌展现出出色的抗菌活性（Shan等人，2020）。不过，目前尚不清楚NKL-24是否也能影响严格厌氧菌的生长。因此，本研究旨在探究NKL-24对产气荚膜梭菌的抗菌及抗生物膜作用。研究通过检测细胞内ATP水平、膜电位去极化程度、膜通透性以及细胞结构的变化来阐明其抗菌机制。同时，还通过检测生物膜的代谢活性、EPS的组成变化以及三维结构改变，研究了NKL-24的抗生物膜性能。通过Caco-2细胞的体外细胞毒性试验以及小鼠的体内急性口服毒性试验，评估了NKL-24的生物相容性。更重要的是，我们以猪肉香肠为模型，评估了单独使用NKL-24或与亚硝酸钠联合使用作为食品防腐剂的潜力。
章节节选
材料
NKL-24（IKNQLAIVCDGIGFLKSLCRWFVN-NH2）由上海GL Biochem有限公司提供，纯度高于95%。产气荚膜梭菌 ATCC 12917购自美国典型培养物收藏中心。SYTO 9/碘化丙啶染色试剂购自中国上海的赛默飞世尔科技公司。ATP和线粒体膜电位检测试剂盒则购自中国上海的贝莱美公司。2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑鎓-5-羧酸铵钠盐（XTT）以及
NKL-24对产气荚膜梭菌生长的影响
已有研究表明，抗菌肽对需氧食源性病原体具有广谱抗菌活性，但对其对严格厌氧病原体作用的研究相对较少。在本研究中，NKL-24对产气荚膜梭菌表现出强烈的抗菌活性，其最小抑菌浓度和最低杀菌浓度均为20 μg/mL。图1A展示了用不同浓度的NKL-24处理后的产气荚膜梭菌生长曲线。OD600 nm值的变化趋势表明，产气荚膜梭菌的生长出现了三
结论
本研究首次发现NKL-24对一种重要的厌氧食源性病原体具有显著的抗菌效果。在40 μg/mL的浓度下，NKL-24可使产气荚膜梭菌的生物膜形成率降至45.54%，清除率则为43.86%。体外细胞毒性试验和小鼠体内急性毒性试验均证明NKL-24无毒性，因此具有食品安全性。实验结果表明，同时含有NKL-24和亚硝酸钠的猪肉香肠能够保持
CRediT作者贡献说明
关宁：方法设计、实验研究。李阳：数据整理。张书琪：软件应用、实验研究。王海华：论文撰写与编辑、资金获取、研究构思。邵冰：软件应用、数据整理。单中华：监督指导、资金获取。戴甸：论文初稿撰写、实验研究、研究构思。陈继成：实验研究、数据分析
未引用参考文献
GB 2760-2024，2024年。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：22465033）、四川省食品微生物学重点实验室开放课题（编号：FM2025-29）以及北京工商大学食品风味与健康交叉创新开放课题（编号：FFHCI-2026007）的支持。同时，感谢中国西北农林科技大学杨凌校区干旱地区作物逆境生物学国家重点实验室的张国云先生在扫描电子显微镜实验方面提供的帮助。
Dian Dai|Jicheng Chen|Ning Guan|Yang Li|Shuqi Zhang|Bing Shao|Zhongguo Shan|Haihua Wang
中国陕西省杨陵市712100，西北农林科技大学食品科学与工程学院
