《Food Microbiology》：Strain-Level Identification and Quantitative Detection of
Lactiplantibacillus plantarum in Fermented Milk Using MALDI-TOF MS
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摘要益生菌的效能具有很强的菌株特异性，但准确识别菌株仍面临挑战。本研究选取广泛用于益生菌产品的植物乳杆菌作为目标微生物，旨在利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术开发一种菌株识别方法。首先，通过对11个菌株的核糖体蛋白序列进行比较分析，发现不同菌株在序列数量和结构上存在显著差
摘要
益生菌的效能具有很强的菌株特异性，但准确识别菌株仍面临挑战。本研究选取广泛用于益生菌产品的植物乳杆菌作为目标微生物，旨在利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术开发一种菌株识别方法。首先，通过对11个菌株的核糖体蛋白序列进行比较分析，发现不同菌株在序列数量和结构上存在显著差异，这为使用MALDI-TOF MS进行菌株区分提供了理论依据。随后，通过正交实验设计优化了甲酸提取方法，确定的最优条件为：取1000微升衰减期培养物，用75%的甲酸进行提取，甲酸与乙腈的体积比为80:80。通过分析主谱图中特征峰的数量、相对强度及位置变化，确定构建单菌株数据库所需的最佳原始谱图数量为10份。基于这些优化参数，成功建立了名为YLp10-2025的植物乳杆菌MALDI-TOF MS数据库。利用该数据库，可对添加了该菌株的商业发酵乳中的不同植物乳杆菌菌株实现精准鉴定与定量检测。本研究建立的基于外部MALDI-TOF MS数据库的菌株识别方法，不仅有助于评估益生菌产品的质量，还为其他微生物的菌株识别方法开发提供了技术支持。
引言
植物乳杆菌因其良好的安全性以及多种健康益处而被广泛用于商业益生菌产品中[1]。然而，越来越多的证据表明，益生菌的功能具有很强的菌株特异性[2]。例如，某些菌株具有更强的耐酸性[3]，而另一些菌株则表现出较强的抗氧化或抗菌活性[3][4]。同样，抑制病原体及调节肠道微生物群的能力也仅存在于特定菌株中，并非所有该物种的菌株都具有这一特性[2]。这些因菌株差异而产生的功能差别，凸显出为植物乳杆菌产品进行准确菌株识别以保障质量和功能评估的必要性[5]。目前，16S rRNA基因测序仍是细菌鉴定的常规标准[6]，但由于不同菌株间的序列相似度通常超过98%，其在菌株水平上的区分能力有限[7]。全基因组测序虽被视为菌株分型的金标准，能提供更高的分辨率，但由于成本高昂、分析流程复杂且需要专业的生物信息学分析，难以在常规或大规模应用中使用[8]。相比之下，基于核糖体蛋白序列的方法有望成为菌株识别的替代方案[9]，因为编码核糖体蛋白的基因相比高度保守的16S rRNA基因具有更高的序列变异度，同时还能保持功能稳定性[10]。
MALDI-TOF MS已成为一种强大的微生物鉴定工具[11]。该技术主要检测核糖体蛋白，是因为它们在细胞中的含量较高、在种内相对稳定，且分子量处于最佳检测范围（2–20 kDa）内[12]。MALDI-TOF MS已被广泛用于微生物的种级[13]和亚种级鉴定[14]。例如，Seng等人[15]报告称，1660个细菌分离株中有84.1%可通过该技术实现种级准确鉴定；Zaluga等人[16]则成功区分了棒状杆菌属中的五个亚种，其结果与gyrB基因测序结果一致。尽管取得了这些进展，但使用MALDI-TOF MS进行菌株区分仍面临挑战。这一限制主要是由于核糖体蛋白的高度保守性[17]，这类蛋白可能缺乏足够的变异度，无法在亲缘关系相近的菌株间产生明显的光谱特征差异。此外，现有的商业数据库（如Bruker和VITEK MS数据库）主要是为快速临床诊断而设计的[18][19]，因此对环境或食品源菌株的覆盖范围有限且不均衡[20]。例如，Bruker的标准商业数据库（DB-10833）仅包含9种植物乳杆菌的参考光谱，不足以实现可靠的菌株区分。另外，光谱质量还受培养条件、样品前处理和提取方法以及仪器状态等多种因素的影响[21][22]。这些参数的差异性和标准化程度不足，可能会掩盖亲缘相近菌株之间细微但具有诊断意义的光谱差异。不过，有研究表明，通过补充经过整理的内部数据库，可显著提高鉴定精度[23][24]。例如，Shao等人报告称，增加参考菌株的数量后，曲霉属物种的鉴定率从64.3%上升到了85.7%[25]。同样，Hong等人[26]发现，使用商业数据库鉴定脑膜炎奈瑟菌的符合率仅为67%，而经过数据库优化和扩展后这一比例上升到了92%。基于这些研究结果，本研究旨在通过扩充植物乳杆菌的参考菌株库来构建专门的内部数据库，从而评估MALDI-TOF MS在实现精确菌株识别方面的可行性。
章节节选
细菌菌株与培养条件
本研究使用的细菌菌株列表见表1。由于所有分离株都属于植物乳杆菌物种，为便于表述，本文中均直接使用其菌株编号。所有菌株均在37°C的无氧条件下，于MRS培养基（青岛希望生物科技有限公司，中国青岛）中培养。
仪器与试剂
Microflex MALDI-TOF MS仪器（InstrumentId:8256969.10013）、96孔靶板、α-氰基-4-羟基肉桂酸矩阵以及相关试剂。
植物乳杆菌核糖体蛋白序列的比较分析
鉴于核糖体蛋白在细菌分类学及基于质谱的鉴定中的应用潜力，我们首先分析了11个具有全基因组序列数据的植物乳杆菌菌株的核糖体蛋白组成及序列变异情况。此项分析旨在评估使用MALDI-TOF MS进行菌株区分的理论可行性。
左侧的条形图显示了每个菌株中检测到的核糖体蛋白总数，顶部的条形图则展示了每个分组中共有多少种相同的核糖体蛋白。
讨论
益生菌的效能和功能特性已被证实具有很强的菌株特异性[31]。因此，准确的菌株识别对于益生菌的工业应用、产品质量控制以及满足监管要求至关重要。尽管全基因组测序目前被视为最全面、最可靠的菌株分型方法，但由于成本高昂、分析周期长以及需要专业的生物信息学知识，其常规应用仍较为有限。近年来，
CRediT作者贡献说明
谭忠发：撰写——初稿、方法学、研究实施、正式分析、数据整理、概念构思。刘彦荣：撰写——审阅与编辑、验证。王志豪：撰写——初稿、验证。周思思：验证。尹大祥：验证、正式分析、数据整理。王晓丽：研究实施、正式分析、数据整理。杨耀：撰写——审阅与编辑、方法学、研究实施、资金获取、正式分析、数据整理、概念构思。
资助情况
本研究得到了中国国家重点研发计划的资助（项目编号：2024YFF0619500）。
利益冲突声明
?所有作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
在此，我还要衷心感谢南京食品药品检验研究院的程一宇先生/博士/教授，在本研究过程中给予我的宝贵帮助与大力支持。
Zhongfa Tan|Yanrong Liu|Zhihao Wang|Sisi Zhou|Daxiang Yin|Xiaoli Wang|Yao Yang
中国南京210046，南京师范大学食品科学与制药工程学院，学林路2号
