综述：重新思考多糖高级结构的解析方法

《Food Hydrocolloids》：Rethinking the resolution of the advanced structure of polysaccharides

　　摘要：多糖是存在于许多自然资源中的丰富多样的生物聚合物。由于糖单元的多样性以及它们之间的连接和排列方式，使得解析其生物分子结构变得十分复杂。尽管已有成熟的分析方法，但其中很多仍是50多年前发展起来的，需要专业的知识和分析技能才能保证准确性。本文从工作流程的角度，分析了整个分析过程中常见的错误，并指出了支持某一结构结论所需的最少证据。要成功分析并正确解读数据，既需要细致入微的关注，也需要丰富的经验。多糖的有效水解是一个重大难题，必须在其组成糖分的降解之间找到平衡。来源的异质性、提取的选择性、适当的分级溶解度、目标多糖的均一性以及多糖数据库等问题都需要逐一解决。果胶和植物细胞壁作为最复杂的例子被用作主要研究对象。由此得出的经验可推广到其他重要的食品水胶体。我们希望为那些致力于研究复杂食品碳水化合物的人提供一些实用指南，帮助他们更快地掌握相关知识。

引言：多糖（也称为复杂碳水化合物、碳水化合物聚合物和糖链）是一种灵活且功能多样的生物聚合物（Di Lorenzo等人，2022；Seidi等人，2022）。它们在自然界中广泛存在，具有共同或特定的功能。例如，糖原、淀粉、菊粉以及某些植物种子多糖（如刺豆胶和瓜尔胶）可作为能量储存物质。它们还能通过形成三维交联聚合物网络，为植物组织提供结构完整性和机械强度。纤维素和几丁质，以及在较小程度上的木聚糖和甘露聚糖，可通过紧密的链状排列形成坚硬的固体结构或坚韧的纤维。在陆地植物的纤维素细胞壁中，一般认为纤维素微纤丝（由半纤维素连接）承担着承重作用，而果胶则对细胞壁的硬度起着关键作用（Amos等人，2022；Bidhendi & Geitmann，2016；Voragen等人，2009）。在海洋生物中，琼脂、海藻酸盐和卡拉胶具有类似的功能（Knorr & Augustin，2021；Mandal等人，2023；Rhein-Knudsen & Meyer，2021；Zhu等人，2021）。几丁质则是真菌细胞壁以及节肢动物外骨骼的主要成分（Izadi等人，2025）。多糖还可以作为保护物质，比如微生物细胞外的多糖，它们能在微生物细胞周围形成黏滑的涂层，保护细菌免受环境压力，促进生物膜的形成（Birch等人，2019；Kaur & Dey，2023）。动物多糖，如透明质酸、硫酸软骨素以及其他相关的黏多糖，在调节某些生理液的性质以及构建细胞间基质方面发挥着重要作用（Abatangelo等人，2020；Ji等人，2020）。

了解多糖的初级结构（或内在共价架构）是基础：它有助于对多糖进行分类、了解其活性和生理功能；有助于理解其在固态或溶液状态下的三维构象和更高级的结构；还有助于了解碳水化合物链的合成或自然降解机制。多糖的初级结构以及二级、三级和四级结构的概念与其他生物聚合物的概念类似（Diener等人，2019）。初级结构指的是沿链排列的单体单元的共价序列：包括单糖组成、糖残基的构象、糖苷键的类型和连接顺序，以及主链和支链的连接位点。二级结构则决定了连续单体在空间上的排列方式，从而确定分子主链的构象。在碳水化合物中，相邻糖分子之间的共价连接并非完全灵活，一条孤立的多糖链只能在有限的相对取向范围内呈现特定的形状，而这种形状又受到多糖主链内部氢键的进一步限制。多糖的二级结构（也称为构象）常见形式有带状结构和螺旋结构。三级结构代表了一种更为复杂的结构组织形式，其中各形状链之间（包括羟基、羧基和氨基）的能量有利相互作用，可形成有序且规则的特定空间构象。已知的三级结构例子包括多螺旋结构或带状结构的聚集体，比如葡聚糖的三螺旋结构或纤维素微纤丝。最后，这些紧凑的单元（多条聚合物链）可能通过非共价键相互作用，形成更高层次的结构，即四级结构。淀粉颗粒就是高度有序的四级结构的典型例子。从植物和动物中分离出来的大多数多糖在固态时都呈现出有序的分子构象，这种构象在溶液中也可能保持不变。通常，功能更多地取决于更高阶的（溶液状态）结构，而非仅靠初级结构。但这并不意味着初级结构不重要：正是初级结构与所处环境共同决定了哪些更高阶的构象是可能的，因此初级结构依然是基础。由于碳水化合物链在结构上极为复杂且构象多变，用于研究其更高阶结构的方法在实际应用中存在诸多局限和误解。

没有一种多糖分析系统是完美的，某些特定因素可以解释为何多糖结构的研究进展远远落后于过去30年里蛋白质或核酸领域的飞速发展。根本问题在于多糖结构的多样性，这一多样性可从三个层面体现出来。首先，多糖没有固定的序列（不同于蛋白质或核酸），其结构是由规则决定的，这就带来了更大的变异可能性。一条孤立的多糖链总是由不同长度的分子混合而成，而且各亚单元的比例也往往不同。其次，多糖的单体（即糖类，属于含有一个醛基或酮基的多元醇）是立体异构体，也就是说它们的原子组成相同（CxH2xOx），这使得通过质谱法对它们进行区分变得极为困难，因为碎片无法直接识别，而核磁共振或红外信号则会出现重叠。第三，尽管这些多糖的组成和官能团相似，但它们能够形成多种不同的糖苷键，从而产生不同的构象，甚至出现分支结构。这就导致即使单体组成相同，其性质也可能大相径庭，以葡萄糖聚合物为例，从形成微纤丝的刚性带状结构（如纤维素）到高度可溶且带有分支的结构（如右旋糖酐），差异十分明显。

此外，技术进步也是一把双刃剑。例如，糖苷键的水解不完全，或者某些糖类在酸水解过程中过度降解，都会导致分析精度下降（Englyst等人，1994；Garna等人，2006；Mankarios等人，1979；Quemener & Thibault，1990）；扫描电子显微镜可能不适合用于分析可溶性多糖；X射线衍射则需要样品具有高度有序的结构以及足够数量的微晶；刚果红试验只能用于检测葡聚糖是否存在三螺旋结构（Guo X等人，2021）；多糖固体样品的粒径或均匀性问题可能会导致ATR-FTIR光谱出现异常波动；多糖通常溶解度低且粘度极高，这会导致核磁共振信号强度降低且信号变宽；质谱法则因相似的原子组成而难以区分，且不太适合用于鉴定高分子量的复杂多糖；与蛋白质相比，糖链的原始3D结构数据较为匮乏。现代物理技术的发展推动了人们对多糖高级结构的研究，提供了强大的技术工具来分析其构象关系，同时也为寻找生物活性多糖、研究其与其它分子的相互作用以及开发植物基食品提供了理论基础（Fayaz等人，2022）。然而，我们也不能忽视这些技术的局限性以及需要解决的瓶颈问题。目前仍在使用的许多方法都是50多年前开发的，其局限性早已被忽视。那么，多糖结构的研究是比几十年前有了进步，还是停滞不前了呢？因此，本综述将探讨多糖高级结构分析方法中存在的一些缺陷和不容忽视的局限性。在整篇综述中，我们以果胶和植物细胞壁作为主要研究案例。这是经过刻意选择的，因为它们是最为异质且结构最不规则的多糖组合，因此是对任何分析方法最具挑战性的测试对象。影响其对果胶分析的错误通常也会影响到更简单的体系。此外，两位作者都拥有丰富的实际操作经验，曾遇到过许多已发现的局限性。不过，我们所讨论的误解是基于方法本身的，而非特定于果胶的。

本综述不会详细介绍每种技术的复杂内容，因为已有其他专题综述或著作对此进行了详细阐述，例如质谱法（Granborg等人，2022；Harvey，2021；Nicolardi等人，2021；J. Wang等人，2023）、固态/液态核磁共振法（H. N. Cheng & Neiss，2012；Fontana & Widmalm，2023；Ghassemi等人，2022；Speciale等人，2022）、光谱技术（Bonnardel等人，2019；Lee等人，2017；Lin等人，2025；X. Liu, Renard, Bureau等人，2021；Pitkanen，2025）、原子力显微镜法（J. Wang & Nie，2019）、分子动力学法（Perez & Makshakova，2022）、人工智能技术（Bojar & Lisacek，2022；Z. Cao等人，2026；Zhang & Xu，2026）。本综述的重点将是介绍用于分析多糖的最常用技术中存在的一些问题。我们重点关注早期且贯穿始终的关键步骤：提取的选择性、水解与降解之间的权衡、纯化过程中的误差以及数据库的不足。这些步骤决定了后续的高精度分析是否有意义。此外，我们还将简要介绍一些关键问题和基本概念，以便读者能够轻松进入这一领域，并通过简洁实用的方式积累实践经验，从而促进该领域的知识传播。

片段摘录：为什么糖苷键很重要：关于碳水化合物聚合物结构的一般考虑。多糖是最为多样且数量最多的生物聚合物类别之一。它们包含多种类型的糖链单元，这些单元通过不同的糖苷键连接在一起，还有各种组合形式。与蛋白质或核酸相比，糖苷键的多样性增加了结构的复杂性，尤其是因为糖苷键能够形成分支结构，而这在天然大分子中是独一无二的特征（Rees & Welsh，1977；Stoddart等人，1969）。

提取：在自然系统中，多糖很少以游离状态存在且可溶。这一规律的主要例外是细菌或真菌产生的胞外多糖。这些多糖是在微生物生长和培养过程中分泌到外界介质中的，但仍然需要进行后续处理以去除细胞并实现纯化（Garcia-Ochoa等人，2000；Kreyenschulte等人，2014）。典型的胞外多糖例子包括由野油菜黄单胞菌产生的黄原胶，它被广泛用于……

用于解析多糖结构的分析方法：如引言中所述，没有一种多糖分析系统是完美的，技术进步是一把双刃剑。当前多糖分析所面临的挑战和主要问题可类比为桶中长短不一的木杆，如图2所示。图3总结了总体方案和方法选择。在讨论具体方法之前，表2列出了在整个分析流程中反复出现的误解。

结论：在复杂的多糖结构分析工作中，不存在一种适用于所有类型天然多糖结构测定的通用方法。首先，需要获得尽可能高纯度的多糖，同时要在水解和降解之间取得平衡，以实现目标多糖的高产率。多糖的初级结构至关重要。为了满足对初级结构进行高精度科学分析的需求，需要……

CRediT作者贡献声明：Xuwei Liu：撰写——初稿、可视化、验证、监督、项目管理、研究、资金获取、概念设计。Catherine M.G.C.雷纳德：写作——审阅与编辑、验证、参考资料。未标注出处的参考文献包括：郭等人，2016年；李等人，2022年；刘等人，2021年；刘等人，2021年；刘等人，2021年；王等人，2021年；王等人，2023年。利益冲突方面，作者声明不存在任何利益冲突。利益冲突声明：? 作者声明自己没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。致谢：刘旭伟想向多糖领域的先驱们表示感谢。本研究得到了广东省自然科学基金（2026A1515010535，2025A1515010497）、广东省科学技术协会青年科技人才培育计划（SKXRC2026252）以及中国国家自然科学基金（编号32202022）的资助。刘旭伟 | 凯瑟琳·M.G.C. 雷纳德，中国广州市510642，华南农业大学食品科学学院，广东省食品质量与安全重点实验室。